本文選題：睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 + 分子克隆�。� 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：目的: 利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆大鼠睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNTF)基因片段,構(gòu)建腺相關(guān)病毒表達(dá)載體,為探討CNTF 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.采用基因拼接的方法克隆大鼠CNTF 的ORF(開放讀碼框)DNA 片段,所得的DNA 片段經(jīng)SalⅠ和XbaⅠ雙酶切后定向插入腺相關(guān)病毒載體AAV-MCS質(zhì)粒中構(gòu)建成pAAV-CNTF。2.pAAV-CNTF 和另外兩種質(zhì)粒pHelper、pAAV-RC 通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞,包裝成帶有CNTF 的重組腺相關(guān)病毒。收集病毒顆粒,同時(shí)以pAAV-LacZ 作為報(bào)告基因和pHelper、pAAV-RC 三種質(zhì)粒在和pAAV-CNTF 完全相同的條件下共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞,通過β—半乳糖苷酶染色測(cè)定轉(zhuǎn)染率,收集病毒原液。以不同稀釋梯度的病毒感染HT-1080 細(xì)胞,通過β—半乳糖苷酶染色測(cè)定病毒滴度。 結(jié)果:1.測(cè)序證實(shí)CNTF 與GeneBank 提供的原始序列完全一致。酶切鑒定與PCR篩選證實(shí)重組質(zhì)粒和預(yù)期結(jié)果完全一致。2.藉β—半乳糖苷酶原位染色法檢測(cè)報(bào)告基因LacZ 在人纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080)中的表達(dá)測(cè)得重組病毒滴度為7.0×10~7個(gè)"ml。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)成功地克隆了CNTF 基因并構(gòu)建了其腺相關(guān)病毒表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究用CNTF 基因轉(zhuǎn)染的方法來(lái)促進(jìn)視神經(jīng)損傷修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aim: to clone the rat ciliary nerve growth factor (CNTF) gene fragment and construct the adeno-associated virus expression vector by molecular biological technique, so as to study the effect of CNTF on rat retinal ganglion cells (RGCs). Methods: 1. The ORF (Open Reading frame) DNA fragment of rat CNTF was cloned by gene splicing. The DNA fragment was digested by Sal 鈪，

本文編號(hào)：2079876