本文選題：單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌 + 李氏溶血素�。� 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 單核增生性李斯特桿菌(Listeria Monocytogenes，LMO)是一種重要的人畜共患食源性疾病致病菌，可引起人和動物的腦膜炎、敗血癥等疾病，病死率非常高。李氏溶血素(Listeriolysin O，LLO)由LMO分泌，是LMO特有的毒力因子，在其感染機(jī)體的過程中，發(fā)揮極為重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)系統(tǒng)pGEX-6P-hly／BL-21表達(dá)的重組LLO，經(jīng)純化作為免疫抗原，免疫BALB／c小鼠，以LMO—0586于BHI培養(yǎng)基中分泌的天然LLO為篩選抗原，檢測抗LLO單克隆抗體。經(jīng)過細(xì)胞融合，建立間接ELISA方法，采用有限稀釋法，經(jīng)三次亞克隆，獲得6株穩(wěn)定分泌抗LLO單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為ⅠF5、ⅡC4、ⅡE5、ⅢG7、ⅣB7、ⅣE9。 經(jīng)亞類鑒定其中ⅠF5、ⅡC4、ⅣE9、ⅡE5分泌的單克隆抗體為IgG1型，ⅣB7、ⅢG7分泌的單克隆抗體類型為IgM型，所有都是κ鏈抗體；雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目平均在85-103條；間接ELISA檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)ⅠF5、ⅡC4為1：512，ⅣE9、ⅣB7、ⅢG7為1：256，ⅡE5細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1：128；以分泌性較好的ⅡC4細(xì)胞株大量制備腹水單抗，經(jīng)檢測其效價(jià)為1：10~5，Western blot檢測該單克隆抗體具有很好的反應(yīng)特異性；阻斷ELISA檢測溶血素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此單抗對天然李氏溶血素有較好的結(jié)合能力，不與葡萄球菌、鏈球菌、丹毒桿菌所分泌的溶血素結(jié)合，說明所制備的抗重組LLO單克隆抗體對病原檢測具有高度的特異性。 本研究還以純化的重組LLO包被ELISA微量反應(yīng)板，以制備的腹水單抗為診斷抗體，然后用此診斷抗體分別與BHI培養(yǎng)基和TSB-YE培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同時(shí)段的LMO上清發(fā)生反應(yīng)，初步在實(shí)驗(yàn)室建立了阻斷ELISA檢測LMO的方法。使用TSB-YE培養(yǎng)基，其檢出時(shí)間和檢菌限值分別為增菌后5h和9.5×10~5個(gè)／ml，使用BHI培養(yǎng)基其檢測時(shí)間和檢菌限值分別為增菌后5.5h和2.7×10~6個(gè)／ml，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)從不同培養(yǎng)基繁殖細(xì)菌效果看，相同的培養(yǎng)時(shí)間BHI培養(yǎng)基的增菌數(shù)要大于TSB-YE培養(yǎng)基，而從細(xì)菌產(chǎn)生LLO的能力上看，使用TSB-YE培養(yǎng)基要明顯強(qiáng)于BHI培養(yǎng)基，可以更早的檢出LMO，這為進(jìn)一步研制LMO快速檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Listeria monocytogenes LMO (LMO) is an important zoonotic disease pathogen, which can cause meningitis, septicemia and other diseases in humans and animals, and the mortality is very high. Listeriolysin O LLO, secreted by LMO, is a unique virulence factor of LMO and plays an important role in the process of infection. In this experiment, recombinant LLOs expressed in prokaryotic expression system pGEX-6P-hlyhly- / BL-21 were purified as immune antigen to immunize BALB / c mice, and natural LLO secreted by LMO-0586 in BHI medium was used as screening antigen to detect anti-LLO monoclonal antibody. After cell fusion, an indirect Elisa method was established and six hybridoma cell lines stably secreting monoclonal antibodies against LLO were obtained by using limited dilution method and three subclones. The hybridomas were named 鈪，

本文編號：2074290