本文選題：霍亂弧菌 + 甘露醇　； 參考：《蘇州大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的:O1群El Tor型霍亂弧菌流行株(主要為產(chǎn)毒株)和非流行株(主要為非產(chǎn)毒株)山梨醇和甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)有明顯差別。為研究這種差異,本研究中確定預(yù)測(cè)的O1群El Tor型霍亂弧菌甘露醇磷酸烯醇丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)(PTS)基因簇mtl產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)甘露醇的功能;比較El Tor型霍亂弧菌的流行株(山梨醇和甘露醇慢發(fā)酵)與非流行株(山梨醇和甘露醇快發(fā)酵)兩類菌株在甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)中mtlCBA基因轉(zhuǎn)錄水平差異的普遍性,明確mtl基因簇中調(diào)節(jié)基因mtlR的調(diào)節(jié)作用,以探索兩類菌株對(duì)甘露醇發(fā)酵快慢的機(jī)理。 方法:采用基因缺失、回補(bǔ)的方法,對(duì)霍亂弧菌mtl基因簇中推測(cè)結(jié)構(gòu)基因mtlCBA和推測(cè)調(diào)節(jié)基因mtlR基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。擴(kuò)大檢測(cè)菌株數(shù)量,對(duì)10株快發(fā)酵菌株(非流行株)和10株慢發(fā)酵菌株(流行株)在甘露醇發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵液pH值變化進(jìn)行檢測(cè),用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量的方法、比較兩類菌株mtl操縱子中mtlCBA基因轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)發(fā)酵過程中的差異。另外,利用海腎熒光素酶(Rluc)報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)兩類菌株中mtlCBA啟動(dòng)子活性的高低。利用pET蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)對(duì)MtlR調(diào)控蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化。 結(jié)果:慢發(fā)酵株N16961的mtlCBA缺失株N16961-dmtlCBA和快發(fā)酵株93097的mtlCBA缺失株93097-dmtlCBA在甘露醇作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受限,在甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中不出現(xiàn)顏色轉(zhuǎn)變,發(fā)酵反應(yīng)轉(zhuǎn)為陰性,而生長(zhǎng)速度不受影響;慢發(fā)酵株N16961的mtlR缺失株N16961-dmtlR和快發(fā)酵株93097的mtlR缺失株93097-dmtlR在甘露醇發(fā)酵液及M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度均比相應(yīng)野生株略快,發(fā)酵反應(yīng)也比相應(yīng)野生株提前。隨機(jī)選擇10株慢發(fā)酵株(流行株)和10株快發(fā)酵株(非流行株),測(cè)試甘露醇發(fā)酵過程中這些菌株mtlCBA轉(zhuǎn)錄水平的差異,比較發(fā)現(xiàn)早期(第1、2小時(shí))顯示快發(fā)酵株mtlCBA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于流行株;而第4、8小時(shí)則相反。在甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)第4小時(shí)(非流行株出現(xiàn)陽性反應(yīng)),被檢測(cè)的多數(shù)快發(fā)酵菌株生長(zhǎng)較慢發(fā)酵株迅速,但部分快發(fā)酵株生長(zhǎng)濃度低于慢發(fā)酵株,但mtlCBA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平仍高于慢發(fā)酵株。慢發(fā)酵株出現(xiàn)發(fā)酵陽性反應(yīng)時(shí)(第8小時(shí))生長(zhǎng)濃度等于快發(fā)酵株。利用海腎熒光素酶(Rluc)檢測(cè)兩類菌株mtlCBA啟動(dòng)子活性,也顯示整個(gè)甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)過程中快發(fā)酵菌株的mtlCBA啟動(dòng)子區(qū)活性始終遠(yuǎn)高于慢發(fā)酵株的。研究中還表達(dá)純化了帶His標(biāo)簽的負(fù)調(diào)控蛋白MtlR以用于對(duì)其調(diào)控作用的進(jìn)一步研究。 結(jié)論:霍亂弧菌甘露醇PTS操縱子中結(jié)構(gòu)基因mtlCBA負(fù)責(zé)將底物由胞外轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)。調(diào)控基因mtlR表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白,對(duì)mtlCBA結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起抑制作用,但不是引起快慢發(fā)酵株發(fā)酵差異的直接原因�；魜y弧菌兩類菌株甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)中甘露醇PTS操縱子轉(zhuǎn)錄差異、啟動(dòng)子活性高低應(yīng)是流行株和非流行株發(fā)酵差異的原因。我們的研究提示在流行株(慢發(fā)酵株)和非流行株(快發(fā)酵株)中有其它的調(diào)控因素、通過不同的作用機(jī)制作用于序列相同的mtlCBA啟動(dòng)子區(qū),使之對(duì)啟動(dòng)mtlCBA轉(zhuǎn)錄的作用表現(xiàn)有強(qiáng)弱差別,造成流行株和非流行株的甘露醇發(fā)酵差異。
[Abstract]:Objective : In order to study the difference of mtlCBA gene transcription level in the isolates of El Tor and non - epidemic strains ( mainly non - producing strain ) and non - epidemic strains ( mainly non - producing strain ) and non - epidemic strains ( mainly non - producing strain ) and mannitol fermentation experiment , it was found that the difference of mtlCBA gene transcript level in the fermentation test of mannitol and mannitol was compared with that of non - epidemic strains ( sorbitol and mannitol ) .






Methods : The mtlCBA and Mtl gene mtlR genes were identified in the mtl gene cluster by means of gene deletion and recovery . The growth curve and the pH value of the fermentation broth were detected by means of real - time fluorescence quantitative PCR .






Results : The mtlCBA deletion strain N16961 - dmtlR of the slow fermentation strain N16961 - dmtlR and the mtlR deletion strain 997 - dmtlR of the fast - fermenting plant were much faster than those of the corresponding wild strains . The results showed that the growth rate of mtlCBA was higher than that of the corresponding wild strain in the fermentation experiment .






Conclusion : The structure gene mtlCBA is responsible for the transfer of substrate from extracellular to intracellular . The expression of mtlR regulates the transcriptional regulation of mtlR , but it is not the direct cause of the difference of fermentation .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378

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