本文選題：第三代慢病毒載體 + 包裝細胞系　； 參考：《沈陽藥科大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：慢病毒載體因為可以介導(dǎo)外源基因在非分裂細胞中穩(wěn)定高效地表達而成為轉(zhuǎn)基因動物和基因治療研究的重要工具。為了能夠制備安全的慢病毒，慢病毒的元件被構(gòu)建在多個質(zhì)粒上以減少因重組產(chǎn)生可復(fù)制病毒的可能性，其中最具代表性的是基于HIV-1的第三代慢病毒載體系統(tǒng)：包括(1)編碼病毒核心蛋白(Gag)和病毒復(fù)制所需酶類(Pol)的質(zhì)粒；(2)編碼Rev蛋白的質(zhì)粒；(3)編碼水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)的包膜蛋白的質(zhì)粒；(4)攜帶目的基因的慢病毒載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染上述元件到293T細胞可以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的慢病毒，但費時費力是這種方法的主要缺點。 本研究的目的在于為第三代慢病毒載體建立一個包裝細胞系以優(yōu)化慢病毒的產(chǎn)出。由于包膜蛋白VSVG的過量表達可能會引起細胞形態(tài)的改變甚至細胞的死亡，我們將包膜蛋白VSVG構(gòu)建在了一個單質(zhì)粒的四環(huán)素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)上，使VSVG的表達可以人為地調(diào)節(jié)，保證細胞的穩(wěn)定傳代。 首先將編碼慢病毒包裝蛋白的質(zhì)粒pLP1-zeo、pLP2、pTRE2rtTAG共轉(zhuǎn)染到293FT細胞，經(jīng)過篩選，得到了79個Zeocin抗性細胞克隆，然后進行PCR鑒定以驗證DNA已經(jīng)整合到細胞基因組上，得到了6個gag／pol、rev、VSVG和rtTA全部呈陽性的細胞克隆，，進一步RT-PCR分析得到了3個具有所有慢病毒元件轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞克隆。最后用Northern確定VSVG的mRNA是否可以誘導(dǎo)產(chǎn)生，結(jié)果顯示，3個細胞克隆在沒有強力霉素誘導(dǎo)的條件下都沒有信號，而經(jīng)過強力霉素誘導(dǎo)后有兩個細胞克隆檢測到了mRNA，因此這兩個細胞克隆就是我們所需要的穩(wěn)定細胞系。 用攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的慢病毒載體pLenti4-EGFP來轉(zhuǎn)染一個生長狀況良好的細胞克隆，收集細胞上清液感染新鮮的293FT細胞，在熒光顯微鏡下檢測到了EGFP的表達，說明有慢病毒產(chǎn)生。通過計數(shù)表達EGFP的細胞個數(shù)來計算慢病毒的滴度，大約為10~4IU／mL，同時檢測不到可復(fù)制病毒的產(chǎn)生，因而是安全的。 總之，我們建立了一個四環(huán)素誘導(dǎo)的包裝細胞系，這個細胞系可以很方便地產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的慢病毒，為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Lentivirus vector has become an important tool for transgenic animals and gene therapy because of its ability to mediate the stable and efficient expression of foreign genes in non-mitotic cells. In order to be able to prepare a safe lentivirus, the lentivirus elements are constructed on multiple plasmids to reduce the possibility of replicating viruses due to recombination. One of the most representative is the third generation lentivirus vector system based on HIV-1: (1) plasmids encoding viral core protein (Gag) and required enzymes for viral replication (Pol); (2) plasmids encoding Rev protein; (3) the plasmid encoding the envelope protein of vesicular stomatitis virus G protein (VSVG); (4) the lentivirus vector carrying the target gene, which can produce replication-deficient lentivirus by transient transfection of the above elements into 293T cells. But time-consuming and laborious is the main disadvantage of this method. The aim of this study was to establish a packaging cell line for the third generation lentivirus vector to optimize the production of lentivirus. Because the overexpression of VSVG may cause cell morphology change and even cell death, we constructed the envelope protein VSVG on a tetracycline inducible expression system of a single plasmid, so that the expression of VSVG can be artificially regulated. Ensure stable passage of cells. Firstly, the plasmid pLP1-zeotTAG encoding lentivirus packaging protein was cotransfected into 293FT cells. After screening, 79 Zeocin-resistant cell clones were obtained, and then PCR was performed to verify that the DNA had been integrated into the cell genome. Six cell clones with positive expression of VSVG and RTTA were obtained, and three cell clones with all the transcription products of lentivirus elements were obtained by RT-PCR. Finally, Northern was used to determine whether VSVG mRNA could be induced. The results showed that all three cell clones had no signal without doxycycline induction. MRNAs were detected in two cell clones induced by doxycycline, so these two cell clones are the stable cell lines we need. A lentivirus vector pLenti4-EGFP carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used to transfect a well growing cell clone. The supernatant was collected and infected with fresh 293FT cells. The expression of EGFP was detected under fluorescence microscope. This indicates that a lentivirus is produced. The titer of lentivirus was calculated by counting the number of cells expressing EGFP. The titer of lentivirus was about 10 ~ (4) U / m ~ (L), and the production of replicable virus could not be detected at the same time, so it was safe. In conclusion, we have established a tetracycline induced packaging cell line, which can easily produce replication-deficient lentivirus and lay the foundation for the production of transgenic animals.
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

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本文編號：2070420