本文選題：基質(zhì)金屬蛋白酶-2 + 單克隆抗體��； 參考：《蘇州大學(xué)》2005年博士論文

【摘要】：基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2) 是由Huhtala P.等人在1990 年克隆表達的,其結(jié)構(gòu)中含有信號肽、前肽、催化區(qū)、纖維連接蛋白樣區(qū)域及血紅素結(jié)合樣區(qū)域。人類MMP-2基因編碼分子量約72kd 的酶原,經(jīng)活化后水解為65kd 的活性形式。MMP-2 是降解細胞外基質(zhì)骨架蛋白Ⅳ型膠原主要酶之一,其生理功能主要是參與傷口愈合,生殖以及生殖器官的復(fù)舊等。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2 與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、自身性疾病自身免疫性疾病、牙周疾病以及腫瘤組織的血管生成密切相關(guān)。鑒于MMP-2 的重要病理生理功能,本研究旨在基礎(chǔ)和臨床兩方面對MMP-2 的功能作進一步探討。通過在體外表達MMP-2 所特有的結(jié)構(gòu)域,我們制備出抗MMP-2 的特異性單克隆抗體, 利用所制備的單克隆抗體初步建立了檢測血清/漿MMP-2 水平的試劑盒,并且對正常人及良惡性腫瘤病人血清MMP-2 水平進行了測定和比較,這為檢測MMP-2 提供了一個有效的工具;運用RNA干擾(RNAi)技術(shù)對MMP-2 基因進行基因沉默,更進一步揭示了MMP-2 的功能及可能的作用機制;同時對基質(zhì)金屬蛋白酶在慢性粒細胞性白血病,這一特殊類型的腫瘤中的作用進行了初步探討。 1. MMP-2 單克隆抗體制備及功能研究 目前發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶所有成員的結(jié)構(gòu)中都含有三個共同的結(jié)構(gòu)域:1 催化區(qū)2 氨基端3 羧基端。此外基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)還有一個特有的區(qū)域,即纖維連接蛋白樣區(qū)域,研究認為它所參與形成的空間結(jié)構(gòu)決定MMP-2 與底物的連接,只有首先與底物連接,進而才可能發(fā)揮酶的活性作用。因此,這一環(huán)節(jié)的阻斷,對抑制內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等有重要意義。 我們根據(jù)GenBank 中MMP-2cDNA 序列設(shè)計引物,體外培養(yǎng)EA hy926 內(nèi)皮細胞,收集細胞后抽提總RNA,利用所合成引物經(jīng)RT-PCR 獲得纖維連接蛋白樣片段cDNA,與pET20b(+)表達載體重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plus,挑選陽性克隆后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達蛋白。蛋白經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖(Ni-NTA agarose)柱純化濃縮后免疫Balb/c 小鼠,尾靜脈加強后取脾細胞融合,ELISA 法篩選陽性克隆,制備腹水。運用Western blot 對抗體進行鑒定,并觀察抗體與天然MMP-2 及純品的反應(yīng)情況, 進行亞型鑒定,組織特異性鑒定同時進行功能實驗:增殖實驗、侵襲實驗以及體外血管新生實驗。結(jié)果顯示:原核表達MMP-2 纖維連接蛋白樣片段大小為21kd,表達量占菌體總蛋白25%,經(jīng)Ni-NTA agarose 柱純化后,獲得了部分純化的蛋白。小鼠脾細胞與雜交瘤細
[Abstract]:The matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) was produced by Huhtala P. It was cloned and expressed in 1990, and its structure contains signal peptide, prepeptide, catalytic region, fibronectin like region and heme binding region. Human MMP-2 gene encodes a proenzyme with a molecular weight of about 72kd, which is hydrolyzed into the active form of 65kd after activation. MMP-2 is one of the main enzymes that degrade extracellular matrix protein type 鈪，

本文編號：2068195