本文選題：基因治療 + 超分子組裝��； 參考：《浙江大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 現(xiàn)代基因技術(shù)和人類基因組工程圖譜的完成為采用基因分子生物學(xué)方法治療各類疾病，提高人類生命質(zhì)量提供了廣闊的前景�；蛑委煹难芯恳呀�(jīng)深入醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，成為當(dāng)今最活躍的生物高技術(shù)領(lǐng)域之一。采用超分子組裝技術(shù)制備的非病毒基因傳遞體系，由于具有合適的納米尺寸、可控的結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景。如何提高非病毒基因載體在體內(nèi)的穩(wěn)定傳遞和高效轉(zhuǎn)染是這類傳遞體系所需解決的關(guān)鍵的科學(xué)問題。病毒是由蛋白質(zhì)殼層所包被的具有核殼結(jié)構(gòu)的天然超分子組裝體，其細(xì)胞外穩(wěn)定存在、細(xì)胞內(nèi)解組裝響應(yīng)并高效轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)為非病毒基因傳遞體系的設(shè)計(jì)提供了很好的啟迪。本論文以構(gòu)建穩(wěn)定傳遞和高效轉(zhuǎn)染的非病毒基因傳遞體系為研究背景，采用超分子組裝技術(shù)與基因技術(shù)相結(jié)合，制備了模擬病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的非病毒基因超分子組裝體，初步探討了超分子組裝體的結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)在聯(lián)系。 聚乙烯亞胺(PEI)具有的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”有利于其從溶酶體中逃離出來，是目前常用的一類非病毒基因載體。但PEI／DNA組裝體在生理鹽溶液中不穩(wěn)定、易聚集，制備PEG化的基因超分子組裝體可解決上述問題。本文首先通過含PEG鏈段的兩親聚合物的自組織共混改性，采用超分子技術(shù)構(gòu)建了基于疏水作用力的新型PEG化基因超分子組裝體。膽固醇—聚乙二醇(CPEG)的加入用量及次序?qū)虺肿咏M裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響。將CPEG與PEI_(25k)的混合溶液加入到等體積的DNA溶液中，制備的PEI_(25k)／CPEG／DNA組裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性得到很大提高；而在PEI_(25k)／DNA組裝體形成之后，再加入CPEG則不能提高其穩(wěn)定性。這一現(xiàn)象顯示新型PEG化基因組裝體的形成，與疏水膽固醇參與到疏水核(由PEI_(25k)和DNA靜電中和形成)的組裝密切相關(guān)。研究進(jìn)一步采用以表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP為模型，將制備的基因超分子組裝體在生理鹽溶液中放置不同的時(shí)間，并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，PEI_(25k)／DNA組裝體的轉(zhuǎn)染效率顯著降低；而通過CPEG共混改性后的PEI_(25k)／CPEG／DNA基因組裝體由于在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性得到很大提高，合適的粒子尺寸使其在體外的基因轉(zhuǎn)染效率顯著提高。含PEG鏈段兩親分子的自組織共混為制備具有新型的PEG化基因超分子組裝體，提高其在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性及基因轉(zhuǎn)染效率，提供了簡(jiǎn)單有效的新途徑。 針對(duì)基因載體與DNA分子在傳遞過程中的穩(wěn)定締合和在細(xì)胞內(nèi)的解離釋放這一對(duì)矛盾，本研究依據(jù)病毒的蛋白質(zhì)殼層細(xì)胞內(nèi)外響應(yīng)傳遞的特點(diǎn)，開展了生物響應(yīng)型非病毒基因傳遞體系的研究。研究利用細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽對(duì)-S-S-鍵的響應(yīng)特性，由低分子量PEI_(1800)出發(fā)，通過與二甲基3，3’-二硫代-雙(丙亞氨酸酯)二氯化氫(DTBP)的交聯(lián)反應(yīng)，合成了一系列含-S-S-鍵的交聯(lián)聚乙烯亞胺(CLPEI)，通過對(duì)交聯(lián)程度和組裝條件的調(diào)控，成功制備了谷胱甘肽響應(yīng)的CLPEI_(50％)／DNA基因超分子組裝體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CLPEI_(50％)具有最佳的締合DNA分子的能力，并在pH值為7.4到5的范圍內(nèi)，依然具有足夠的質(zhì)子緩沖能力，有利于基因超分子組裝體從溶酶體中逃離出來。在pH為6.0、NaCl濃度為20mM的條件下，能與DNA形成直徑在150 nm左右的球形粒子。在模擬細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度的條件下，CLPEI_(50％)分子中-S-S-鍵的斷裂導(dǎo)致高分子量聚陽離子轉(zhuǎn)變?yōu)榈头肿恿科瑪啵瑢?shí)現(xiàn)組裝體的解組裝響應(yīng)。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明：這種仿生交聯(lián)的基因組裝體可顯著降低細(xì)胞毒性，并有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 為進(jìn)一步增強(qiáng)基因超分子組裝體的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率，研究以病毒組裝過程中生物大分子交聯(lián)的“籠狀”結(jié)構(gòu)為啟示，開展了“籠狀”仿生交聯(lián)組裝體的研究。合成了含巰基的聚乙烯亞胺(HS-PEI)，與DNA組裝后，分別通過空氣中巰基的氧化交聯(lián)制備殼層原位交聯(lián)的基因超分子組裝體；通過金納米粒子(AuNP)與巰基的共價(jià)締合，制備殼層納米金交聯(lián)的組裝體。熒光光譜測(cè)定結(jié)果表明：在N／P值為10的條件下，巰基化聚乙烯亞胺(HS-PEI)能有效誘導(dǎo)DNA分子的締合。在pH為6.0、NaCl濃度為20 mM的HEPEs緩沖溶液中，這種殼層交聯(lián)的組裝體的尺寸在150 nm左右。對(duì)于殼層AuNP交聯(lián)的Au-S-PEI／DNA組裝體，由TEM圖片我們可清晰觀察到殼層金納米粒子的存在，且隨著AuNP加入量的增加，殼層交聯(lián)的金納米粒子含量也顯著增加。與殼層未交聯(lián)的基因超分子組裝體相比，殼層交聯(lián)的“籠狀”結(jié)構(gòu)可有效提高組裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性，并顯示出很好的谷胱甘肽響應(yīng)特性。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明：通過選擇合適的組裝條件，仿生交聯(lián)的“籠狀”非病毒基因傳遞體系可有效轉(zhuǎn)染。 采用超分子組裝技術(shù)構(gòu)建仿病毒基因傳遞體系，使其既具備非病毒載體的低毒性、低免疫原性的特點(diǎn)，又具有病毒載體高效轉(zhuǎn)染的特性，將是未來基因傳遞體系的發(fā)展方向。本論文采用超分子組裝手段，通過含PEG鏈段兩親聚合物的 自組織共混改性，制備了新型PEG化基因超分子組裝體；利用谷胱甘肽的生物開關(guān)效應(yīng)，設(shè)計(jì)了含二硫鍵的聚陽離子，，制備了細(xì)胞內(nèi)外響應(yīng)傳遞的非病毒基因傳遞體系；通過制備巰基化聚乙烯亞胺，構(gòu)建了殼層原位交聯(lián)和納米金交聯(lián)的“籠狀”基因超分子組裝體，為新型仿病毒基因傳遞體系的設(shè)計(jì)提供了切實(shí)可行的途徑，并在基因治療領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。
[Abstract]:A non - viral gene delivery system with a core - shell structure coated by a protein - shell layer and a non - viral gene transfer system with the characteristics of stable delivery and high - efficiency transfection are used in the research of the non - viral gene delivery system .









Polyethylenimine ( PEI ) has a " proton sponge effect " which is beneficial to escape from lysosomes . It is a kind of non - viral gene carrier which is commonly used at present . But PEI / DNA assembly is not stable in physiological saline solution and is easy to assemble . It has a great influence on the stability of the molecular assembly of PEG . The addition amount and sequence of cholesterol - polyethylene glycol ( CPEG ) are added to equal volumes of DNA solution , and the stability of PEI _ ( 25k ) / CPEG / DNA assembly in physiological saline solution is greatly improved .
The results showed that the transfection efficiency of PEI _ ( 25k ) / DNA assembly was significantly decreased with the prolongation of placement time .
Compared with the modified PEI _ ( 25k ) / CPEG / DNA gene , the transfection efficiency of the modified PEI _ ( 25k ) / CPEG / DNA gene was improved significantly in the physiological saline solution .









A series of cross - linked polyethylene imine ( CLPEI ) with S - S - bond was synthesized by crosslinking reaction with dimethyl 3,3 ' - dithio - bis ( lactide ) dihydrogenchloride ( DTBP ) under the condition of pH 6.0 and NaCl concentration of 20 mM .









In order to further enhance the stability and transfection efficiency of the gene supermolecular assembly , we studied the " cage " structure of biological macromolecule cross - linking in the process of virus assembly , and carried out the research of " cage - like " bionic cross - linking assembly .
The results show that the cross - linked " cage - like " structure can effectively improve the stability of the shell layer in the physiological saline solution with the increase of the addition of AuNP . The results show that the cross - linked " cage " structure can effectively improve the stability of the assembly in physiological saline solution and show good response characteristics .









By using the super - molecular assembly technology to construct the virus - like gene delivery system , it has the characteristics of low toxicity and low immunogenicity of the non - viral vector , and has the characteristics of high efficiency transfection of the viral vector , which is the developing direction of the future gene delivery system .









The novel PEGylated gene supermolecular assembly was prepared by self - organizing blending modification .
By using the biological switch effect of glutathione , the polycation containing disulfide bond was designed , and the non - viral gene delivery system was prepared .
In this paper , the " cage " gene supermolecular assembly of shell - layer in - situ crosslinking and nano - gold cross - linking is constructed by the preparation of mercaptopolyethylene imine , which provides a feasible way for the design of the novel virus - like gene delivery system , and shows a wide application prospect in the field of gene therapy .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2011634