發(fā)布時(shí)間：2018-06-12 21:41

  本文選題：胚胎干細(xì)胞 + 體外培養(yǎng)��； 參考：《浙江大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：干細(xì)胞研究在人類生命科學(xué)中具有重要的基礎(chǔ)研究意義,在人類健康和生命質(zhì)量領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。胚胎干細(xì)胞來源于受精卵發(fā)育早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),具有發(fā)育的全能性,可以分化為體內(nèi)所有類型的成熟細(xì)胞。在發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞治療、組織器官工程等研究和開發(fā)中具有巨大的潛力。 為了全面認(rèn)識(shí)ES細(xì)胞的特性并為今后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、組織工程研究做好鋪墊,我們進(jìn)行了小鼠ES細(xì)胞的建系研究,以ICR種和昆明種小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用超數(shù)排卵的方法獲得孕3.5d小鼠囊胚,培養(yǎng)在用絲裂霉素C處理過的MEF細(xì)胞飼養(yǎng)層上,選取適當(dāng)時(shí)間離散增殖的ICM和類ES細(xì)胞集落,分析了在小鼠ES細(xì)胞建系過程中,飼養(yǎng)層細(xì)胞、消化液及不同品系來源的胚胎的影響。結(jié)果,ICR小鼠和昆明小鼠兩種來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎貼壁、ICM增殖無影響;消化液濃度和作用時(shí)間對(duì)ICM的影響明顯,以較低濃度的胰酶和EDTA消化為宜;另外,血清質(zhì)量、培養(yǎng)板質(zhì)量等因素可能影響建系。 為了探討小鼠胚胎干細(xì)胞分化神經(jīng)細(xì)胞的功能特性,及其分化過程中N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體的表達(dá)情況,我們利用全反式維甲酸(RA)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞擬胚體定向分化為神經(jīng)細(xì)胞,用攝像相差顯微鏡觀察分化神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài),用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定分化神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)特異性抗原,用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測分化神經(jīng)細(xì)胞Calbindin D28K和NMDA受體(NR)亞型mRNA的表達(dá)情況,用熒光共聚焦顯微鏡檢測分化神經(jīng)細(xì)胞在NMDA刺激下胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度的變化。結(jié)果顯示,1×10~(-6)mol/LRA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)ES細(xì)胞擬胚體4天,在擬胚體周圍出現(xiàn)大量神經(jīng)樣細(xì)胞,分化神經(jīng)細(xì)胞的比率與擬胚體的大小有關(guān);撤除RA繼續(xù)培養(yǎng)4d后可以檢測到NR2B mRNA的轉(zhuǎn)錄,NR2C有弱的轉(zhuǎn)錄;在第6d后NR2A有轉(zhuǎn)錄;在第8d及其之后NR1的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)。撤除RA繼續(xù)培養(yǎng)8天后在擬胚體周圍出現(xiàn)大量神經(jīng)樣細(xì)胞;RT-PCR檢測顯示有Calbindin D28和NR1、NR2A、NR2B、NR2C mRNA的轉(zhuǎn)錄;在NMDA刺激下胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度明顯升高(P0.01)。提示,用RA誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體亞型的表達(dá)與中樞神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體亞型的表達(dá)具有一定的相似性。用RA誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化的神
[Abstract]:Stem cell research has important basic significance in human life science and has a wide application prospect in the field of human health and quality of life. Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the inner cell clusters of the early embryos of fertilized eggs and have the developmental totipotency to differentiate into all types of mature cells in the body. It has great potential in developmental biology, cell therapy, tissue and organ engineering and so on. In order to fully understand the characteristics of es cells and pave the way for future transgenic animals and tissue engineering research, we studied the establishment of mouse es cells. ICR and Kunming mice were used as experimental objects. Mouse blastocysts were obtained by superovulation and cultured on MEF cell feeder layer treated with mitomycin C. ICM and es like cell colonies were selected in appropriate time to analyze the process of establishing mouse es cell line. Effects of feeder cells, digestive fluids and embryos from different strains. Results the feeder layer cells from ICR mice and Kunming mice had no effect on the proliferation of ICM, the concentration of digestive fluid and the time of action had obvious effects on ICM digestion, and the lower concentrations of trypsin and EDTA were suitable for digestion. The quality of culture plate may affect the establishment of the system. To investigate the functional characteristics of mouse embryonic stem cell differentiation neurons and the expression of N-methyl-D-aspartate NMDA-receptor during differentiation. We used all-trans retinoic acid (RAA) to induce the directional differentiation of embryonic stem cells into neuronal cells. The morphology of differentiated neurons was observed by camera phase contrast microscope, and the expression of specific antigen was identified by immunocytochemistry. The expression of Calbindin D28K and NMDA receptor NR- subtype mRNA in differentiated neurons was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that a large number of neuron-like cells appeared around the embryoid body for 4 days after induction on 1 脳 10 ~ (-6) mol / L LRA medium, and the ratio of differentiated nerve cells was related to the size of the embryoid body. NR2C, NR2A and NR1 transcripts of NR2B mRNA and NR2a were detected after 4 days and 8 days, respectively, after the removal of RA for 4 d, NR2C was weakly transcribed, NR2A was transcripted at the 6th day, and NR1 was transcripted at and after the 8th day. After the removal of RA for 8 days, a large number of neuron-like cells appeared around the embryoid body. RT-PCR results showed that there were transcription of Calbindin D28 and NR1NR2ANR2BU NR2C mRNA, and that the concentration of intracellular free Caan2) increased significantly under the stimulation of NMDA. These results suggest that the expression of NMDA receptor subtypes in neural cells induced by RA is similar to that of NMDA receptor subtypes in neural cells during the development of central nervous system. Differentiation of es cells induced by RA
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2011181