本文選題：多表位抗原 + 丙型肝炎病毒�。� 參考：《復旦大學》2005年博士論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)為單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼約3010～3033aa的蛋白前體，從N-端起依次為核心蛋白(C)、包膜蛋白(E)、非結構蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的變異性，能夠迅速突變逃逸宿主的免疫系統(tǒng)。因此，給疫苗的研究帶來許多的困難。近年來的研究提示理想的HCV疫苗必須能夠誘發(fā)高水平、廣譜而特異的體液免疫應答和細胞免疫應答。 針對HCV的高度變異性及免疫特點，在HCV基因產物中優(yōu)選了5個具有良好免疫原性的高度保守B／T細胞表位，組合成一個多表位抗原基因pcx，這些表位分別來自核心蛋白(1～16aa，132～141aa)，E1(126～135aa)，NS3(139～147aa)及NS5B(768～775aa)，以及破傷風毒素的T細胞表位用以增強T細胞免疫。前期的研究表明與β-半乳糖苷酶融合表達的多表位抗原PCX具有良好的HCV免疫特異性。 pcx基因經過串聯(lián)重復之后，構建成多表位抗原基因pcx3，與6×His-tag融合后，在E.coli宿主中獲得高效表達。利用C端融合的6×His-tag經過Ni~(2+)-NTA-agarose親和層析柱純化后，得到高純度的目的蛋白。利用BCA法對蛋白質進行定量。 Western blot結果顯示原核或真核表達的PCX3抗原均能被HCV患者陽性血清所識別，表明多表位抗原具有能被HCV抗體特異性識別的表位。ELISA結果顯示來自不同地區(qū)的不同患者血清中抗-HCV抗體能與PCX3抗原特異反應，62份陽性血清中PCX3抗原檢測的檢出率為83.8％，提示PCX3抗原的B細胞表位能被HCV抗體廣泛識別。而PCX抗原的檢出率為70％，表明經過串聯(lián)重復后的抗原與HCV抗體的反應更強，顯示出良好的免疫原性。 純化的PCX3蛋白與完全弗氏佐劑一起免疫BALB／c小鼠后，能夠誘發(fā)高滴度的特異性IgG(1×10~6)，并持續(xù)保持數月。不同劑量組進行比較，發(fā)現(xiàn)50μg的劑量能夠誘發(fā)理想的體液免疫反應。另外，利用PCX免疫小鼠的特異性抗體 滴度最高達1×10~4，這一結果表明，與PCX抗原相比，串聯(lián)重復的PCX3抗原能夠誘發(fā)更強的免疫反應�？筆CX3抗血清與多肽的反應顯示位于核心蛋白的P1(MTSTNPKPQRKTKRNTN)以及NS3蛋白的P6(TGDFDSVID)這兩個B細胞表位與抗體反應的滴度較高，提示二者在誘導HCV特異的體液免疫反應中發(fā)揮主要作用。 PCX3蛋白可誘發(fā)較高水平的特異性CTL效應，特異性殺傷率為39.2％。在多肽表位中，NS5B的T細胞表位(ELITSCSS)的溶解率最高，提示該表位在誘發(fā)CTL殺傷效應中具有重要的作用。流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞表明，HCV多表位抗原PCX3免疫小鼠6周后，CD3~+CD4~+T細胞比例明顯升高，說明該蛋白可以有效刺激CD3~+CD4~+Th細胞增殖。針對免疫小鼠的安全性評價表明這一多表位抗原免疫是安全而有效的。 利用實時熒光定量PCR技術檢測PCX3抗血清體外與病毒粒子(genotype 2a)的結合，實驗結果表明孵育過夜后，PCX3抗血清在體外能夠結合絕大部分的病毒粒子，初步顯示PCX3抗血清具有抗病毒感染的可能，為進一步抑制病毒感染的試驗提供基礎。 本實驗中用于檢驗體液免疫被動保護反應的模型是SCID／Alb-uPA轉基因小鼠。這種SCID／Alb-uPA純合的小鼠體內進行人體肝細胞移植后，建立具有嵌合的人肝組織的轉基因小鼠。利用HCV陽性血清進行腹膜內注射感染，病毒不僅能夠復制，而且產生了具有感染性的顆粒，可以作為HCV感染的小鼠模型。利用該模型的研究表明HCV陽性血清(HCV genotype la，3.0E+6 IU／ml)與PCX3誘導的高滴度抗血清孵育過夜后進行感染，兩周后檢測發(fā)現(xiàn)實驗組中有兩只小鼠血清中含有低于500U的RNA拷貝數，其它三只血清中的RNA則為陰性，而對照組的7只小鼠全部感染了HCV，血清中的RNA拷貝數為3.0E+03到3.5E+06 IU／ml。這一結果表明PCX3誘導的抗血清能使2／5的小鼠病毒滴度顯著減少，并且保護3／5的小鼠避免HCV感染，在被動免疫保護反應方面發(fā)揮重要的作用。 對PCX3抗血清進行分析，發(fā)現(xiàn)它能與HCV的核心蛋白、NS3蛋白特異性結合，驗證了抗血清中含有抗核心蛋白與NS3蛋白的抗體。利用PCX3抗原制備的單克隆抗體中篩選到兩株分別與HCV核心蛋白以及NS3蛋白結合，一株與 包膜蛋白E1的表位多肽P5(RMAWDMMMW)反應的單抗。表明PCX3誘導的體液免疫反應中包含這三個蛋白的B細胞表位(P1，P5和P6)所引起的免疫反應，且這些單抗可用于進一步研究抗體與病毒粒子的結合。在此基礎上，選取抗核心蛋白的雜交瘤細胞株進行抗體的基因克隆，以期獲得具有應用價值的單鏈抗體，結果篩選到表達特定條帶的陽性克隆株，并經過測序鑒定。為抗體的應用研究奠定基礎。 綜上所述，我們的結果表明，本研究所構建的多表位抗原PCX3可以誘導小鼠產生特異性細胞和體液免疫應答，，產生的抗體不僅能在體外結合基因型2a的HCV病毒粒子，且更重要的是，在小鼠的感染模型中抑制了基因型1a的HCV感染，因此，這一抗原有望成為廣泛而有效的HCV疫苗候選者。
[Abstract]:Hepatitis C virus (HCV) is a single strand positive chain RNA virus, whose genome encodes about 3010 to 3033aa protein precursors, from the N- terminal to the core protein (C), the envelope protein (E), and the non structural protein NS1-NS5B.HCV with high variability, which can quickly mutate the immune system of the host and bring many difficulties to the vaccine research. Studies in recent years suggest that the ideal HCV vaccine must be able to induce high level, broad spectrum and specific humoral immune responses and cellular immune responses.
In view of the high variability and immunity of HCV, 5 highly conserved B / T cell epitopes with good immunogenicity were selected to form a multi epitope antigen gene PCX, which were derived from core proteins (1 to 16AA, 132 to 141aa), E1 (126 to 135AA), NS3 (139 147aa) and NS5B (768 to 768), and broken wounds, respectively. The T cell epitopes of the wind toxin are used to enhance the immunization of T cells. Previous studies have shown that the multi epitope antigen PCX expressed with beta galactosidase has a good HCV specific immune specificity.
After the PCX gene was repeated in series, the gene pcx3 was constructed into a multi epitope antigen gene. After the fusion with 6 x His-tag, the gene was highly expressed in the E.coli host. The purified target protein was obtained by the purification of the Ni~ (2+) -NTA-agarose affinity chromatography column with the fusion of C terminal 6 * His-tag. The protein was quantified by BCA method.
The Western blot results showed that the PCX3 antigen expressed in the prokaryotic or eukaryotic cells could be identified by the positive serum of the HCV patients, indicating that the multi epitope antigen has the epitopes that can be identified by the HCV antibody specific. The anti -HCV antibody in different patients from different regions can respond to the specific reaction of the -HCV antibody to the PCX3 antigen, and the PCX3 antigen in the 62 positive sera is detected. The detection rate was 83.8%, suggesting that the B cell epitope of PCX3 antigen was widely recognized by HCV antibody, while the detection rate of PCX antigen was 70%, indicating that the antigen after tandem repeats was more responsive to the HCV antibody and showed a good immunogenicity.
The purified PCX3 protein was immune to the BALB / c mice with the complete Freund adjuvant and could induce a high titer specific IgG (1 x 10~6) for a few months. Compared with the different dose groups, it was found that the dosage of 50 mu g could induce the ideal humoral immune response. In addition, the specific antibody of mice was immunized with PCX.
The highest titer was up to 1 x 10~4, which showed that the tandem repeat PCX3 antigen could induce a stronger immune response compared to the PCX antigen. The reaction of anti PCX3 antiserum to the polypeptide showed that the P1 (MTSTNPKPQRKTKRNTN) in the core protein and the P6 (TGDFDSVID) of the NS3 protein (TGDFDSVID), the two B cell epitopes of the NS3 protein, were higher in the titer of the antibody reaction, suggesting two It plays a major role in inducing HCV specific humoral immune response.
PCX3 protein can induce a high level of specific CTL effect, the specific killing rate is 39.2%. in the peptide epitopes, and the T cell epitopes of NS5B (ELITSCSS) have the highest dissolution rate, suggesting that the epitope plays an important role in inducing the killing effect of CTL. Flow cytometry shows that the HCV polyepitope antigen is immune to 6 mice in the peripheral blood gonorrhea cells. After week, the proportion of CD3~+CD4~+T cells increased significantly, indicating that the protein could effectively stimulate the proliferation of CD3~+CD4~+Th cells. The safety evaluation of immunized mice showed that the immunization of this multi epitope antigen was safe and effective.
Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the combination of PCX3 antiserum with virus particles (genotype 2a) in vitro. The experimental results showed that after incubation for the night, the PCX3 antiserum could combine with most of the virus particles in vitro, and preliminarily showed that the antisera of PCX3 had the ability of antiviral infection, which provided a basis for the further inhibition test of virus infection.
In this experiment, the model used to test the passive protective reaction of humoral immunity is SCID / Alb-uPA transgenic mice. After transplantation of human hepatocytes in the SCID / Alb-uPA homozygous mice, transgenic mice with chimeric liver tissue were established. The virus can be injected intraperitoneally with HCV positive serum, and the virus can not only be replicated, but the virus can not only be copied, but also the virus can be replicated. The infectious particles could be produced as a mouse model of HCV infection. The study of the model showed that the HCV positive serum (HCV genotype La, 3.0E+6 IU / ml) was incubated with the high titer antiserum induced by PCX3 after night, and two weeks later, two mice in the experimental group were found to contain a RNA copy of less than 500U. The number of RNA in the other three sera was negative, while all the 7 mice in the control group were infected with HCV, and the RNA copy number in the serum was 3.0E+03 to 3.5E+06 IU / ml.. The results showed that the PCX3 induced antiserum could significantly reduce the titer of 2 / 5 mice, and protected 3 / 5 mice from the HCV infection, in the passive immune protection response side. The surface plays an important role.
The antiserum of PCX3 was analyzed. It was found that it could combine with the core protein of HCV, NS3 protein specifically, and verified the antibody containing anti core protein and NS3 protein in the antiserum. Two strains of monoclonal antibodies prepared by PCX3 antigen were selected to bind to HCV core protein and NS3 protein respectively.
The monoclonal antibody to the epitope peptide P5 (RMAWDMMMW) reaction of the envelope protein E1. It shows that the PCX3 induced humoral immune response includes the immune responses caused by the B cell epitopes of these three proteins (P1, P5 and P6), and these monoclonal antibodies can be used to further study the combination of antibodies and viral particles. On this basis, the hybridoma cells with anti core proteins are selected. To clone the antibody gene in order to obtain the applied value of single chain antibody, the positive clones expressing the specific bands were screened and identified by sequencing, which laid the foundation for the application of antibodies.
To sum up, our results show that the multi epitope antigen PCX3 constructed in this study can induce specific cell and humoral immune responses in mice. The produced antibodies not only combine the HCV virus particles of the genotype 2a in vitro, but also, more importantly, inhibit the HCV infection of the genotype 1a in the mouse infection model, thus, this Antigen is expected to become a widely effective candidate for HCV vaccine.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R392

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本文編號：2008372