本文選題：隨機(jī)擴(kuò)增 + 按蚊��； 參考：《安徽理工大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目的 比較分析對約氏瘧原蟲易感的斯氏按蚊和不易感的大劣按蚊的基因組DNA的多態(tài)性，探討媒介按蚊與瘧原蟲遺傳基因間的相互關(guān)系以及為研究大劣按蚊的先天免疫，克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并對其進(jìn)行序列分析。 方法 設(shè)計5條隨機(jī)引物，應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)對斯氏按蚊、大劣按蚊的正常蚊、感染蚊及其幼蟲的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分析比較結(jié)果；并分別提取感染瘧原蟲和細(xì)菌的大劣按蚊的基因組DNA和總RNA，分別以特異引物和簡并引物采用PCR和RT-PCR法擴(kuò)增出目的基因片段，擴(kuò)增的目的片段經(jīng)純化回收后克隆到PMD-18T中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α，經(jīng)TA克隆后測序并進(jìn)行序列分析。 結(jié)果 5條隨機(jī)引物對兩種按蚊擴(kuò)增的條帶數(shù)不同，其中P5對斯氏按蚊擴(kuò)增的效果較好，P4對大劣按蚊擴(kuò)增效果較好，P1對大劣按蚊無擴(kuò)增產(chǎn)物，用P3對兩種按蚊擴(kuò)增，感染前后的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶數(shù)相同，但其表達(dá)量不同；成蚊與幼蟲帶型數(shù)量不同；而瘧原蟲感染的大劣按蚊用簡并引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條219bp目的片段，與埃及伊蚊defensins有95％同源性，基因組DNA用特異引物擴(kuò)出一308bp目的片段，與岡比亞按蚊有100％同源性，細(xì)菌感染的大劣按蚊總RNA用特異引物擴(kuò)增出一條333bp目的片段，與岡比亞按蚊有100％同源性，用簡并引物擴(kuò)出一條188bp目的片段，與岡比亞按蚊有87％同源性，與白蚊伊蚊defensinsD有88％同源性。 結(jié)論：RAPD結(jié)果顯示斯氏按蚊和大劣按蚊之間存在基因差異，同種未感染蚊和感染蚊基因帶型相同，而表達(dá)量存在差異；幼蟲與成蟲的基因差異較大。成功克隆大劣按蚊抗菌肽defensins基因，其與岡比亞按蚊同源性較高。為進(jìn)一步探討按蚊對瘧原蟲感染的先天免疫反應(yīng)，研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to compare and analyze the genetic polymorphisms of Anopheles stephensi and Anopheles dirus susceptible to Plasmodium yoelii, and to explore the relationship between the genetic genes of Anopheles vector and Plasmodium and to study the innate immunity of Anopheles dirus. The antimicrobial peptide defensins gene of Anopheles dirus was cloned and sequenced. Methods five random primers were designed and randomly amplified polymorphic DNA-random amplified polymorphic DNA (RAPDD) technique was used to detect Anopheles stephensi and Anopheles dirus. The genomic DNA of infected mosquitoes and their larvae were amplified randomly, and the results were analyzed and compared by agarose gel electrophoresis. The genomic DNA and total RNAs of Anopheles dirus infected with malaria parasites and bacteria were extracted, and the target gene fragments were amplified by PCR and RT-PCR with specific primers and degenerate primers, and the amplified fragments were cloned into PMD-18T after purification and recovery. DH5 偽 was transformed into Escherichia coli DH5 偽, sequenced and sequenced by TA cloning. Results the number of bands amplified by 5 random primers was different between two species of Anopheles. The amplification effect of P5 to Anopheles stephensi was better than that of P4 to Anopheles inferioris. There was no amplification product of P1 to Anopheles dirus. The number of electrophoresis bands of amplification products before and after infection was the same, but the expression of the products was different when using P3 to amplify the two species of Anopheles dirus. A 219bp fragment was amplified by RT-PCR from Anopheles malarial infected Anopheles dirus with 95% homology with Aedes aegypti defensins, and a 308bp fragment was amplified by specific primers. There was 100% homology with Anopheles gambiae. A specific primer was used to amplify a 333bp fragment from total Anopheles dirus infected by bacteria, and 100% homology with Anopheles gambiae. A 188bp fragment was amplified by degenerate primers. There was 87% homology with Anopheles gambiae and 88% homology with defensinsD of Aedes albopictus. However, there were significant differences in gene expression between larva and adult. The antimicrobial peptide defensins gene of Anopheles dirus was cloned successfully, which had high homology with Anopheles gambiae. In order to further study the innate immune response of Anopheles to Plasmodium infection and to study the biological activity of Anopheles repens antimicrobial peptide.
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R384.1

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本文編號：1987763