本文選題：小發(fā)夾RNA + 潛伏膜蛋白基因1�。� 參考：《青島大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目的 構(gòu)建攜帶針對EBV潛伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞克隆,探討LMP1特異性沉默對EBV陽性細胞凋亡的影響。 方法 采用DNA重組技術(shù)將60nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向LMP1小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA, shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER.retro.neo gfp,并用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定以及測序鑒定;脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞系PA317,G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞克隆;收集病毒上清,感染靶細胞Raji;采用RT-PCR檢測靶基因LMP1的沉默效果,流式細胞術(shù)檢測Raji細胞的凋亡。 結(jié)果 ①酶切鑒定及測序鑒定結(jié)果表明插入片段的序列和方向完全正確;② 重組載體轉(zhuǎn)染包裝細胞,可表達綠色熒光蛋白,經(jīng)G418篩選,得到抗性細胞克隆;③RT-PCR結(jié)果表明pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒可有效抑制Raji細胞中LMP1的表達,流式細胞儀檢測表明LMP1沉默可導(dǎo)致Raji細胞凋亡,同時用細胞凋亡誘導(dǎo)劑TGF-β1處理時更為明顯。 結(jié)論 成功構(gòu)建了特異性沉默EBV潛伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞克隆,初步實驗結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNA干涉能有效沉默靶基因LMP1的表達,并能誘導(dǎo)LMP1陽性細胞Raji的凋亡,為深入探討LMP1基因特異性沉默對EBV陽性腫瘤的治療作用奠定了實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct the retroviral vector of pSUPER.retro.neo gfp RNAi carrying EBV latent membrane protein gene (LMP1) and to screen the stable virulent cell clones and to investigate the effect of LMP1 specific silencing on the apoptosis of EBV positive cells. Methods the oligonucleotide sequence of 60nt which could produce LMP1 small hairpin RNA(small hairpin RNA, shRNA) was cloned into the retroviral vector pSUPER.retro.neo gfp by DNA recombination technique and identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. The recombinant retroviral vector was transfected into the packaging cell line PA317G418 by liposome method, and the stable retroviral clones were obtained. The virus supernatant was collected and infected with Raji. the silencing effect of target gene LMP1 was detected by RT-PCR. Apoptosis of Raji cells was detected by flow cytometry. Results 1 the results of restriction endonuclease digestion and sequencing showed that the sequence and direction of the inserted fragment were completely correct. The recombinant vector transfected packaging cells and expressed green fluorescent protein. After G418 screening, the resistant cell clones were obtained. 3RT-PCR results showed that pSUPER.retro.neo gfp RNAi retrovirus could effectively inhibit the expression of LMP1 in Raji cells. Flow cytometry showed that LMP1 silencing could induce apoptosis of Raji cells, especially when treated with TGF- 尾 1. Conclusion the pSUPER retro RNAi retrovirus vector which specifically silenced the LMP1 gene of EBV latency gene was successfully constructed, and the stable virulent cell clones were screened out. The preliminary results showed that RNA interference mediated by retroviral vector could effectively silence the expression of target gene LMP1 and induce the apoptosis of LMP1 positive cells Raji. It provides an experimental basis for the further study of the therapeutic effect of LMP1 gene specific silencing on EBV positive tumors.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

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本文編號：1926262