本文選題：噬菌體抗體庫 + Fab抗體�。� 參考：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 抗體技術(shù)的出現(xiàn)對醫(yī)學(xué)發(fā)展起了非常重要的推動作用，被廣泛地運用于實驗室研究、疾病的診斷與治療。自20世紀(jì)70年代Kohler和Milstein利用細胞融合技術(shù)成功制備了雜交瘤單克隆抗體(McAb)，其在疾病診斷、治療和預(yù)防等方面顯示出了重要作用。但是，鼠源抗體極易引起人體排異反應(yīng)(Human anti-mouse antibody，HAMA)的特點限制了其在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用。90年代興起的噬菌體抗體庫技術(shù)，從抗體角度為上述難題的解決提供了契機。 噬菌體抗體庫技術(shù)以PCR技術(shù)和噬菌體展示(Phage Display Techniques，PDT)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建噬菌體抗體庫經(jīng)抗原篩選得到特異性抗體成為獲得人源抗體分子的有效途徑。該技術(shù)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，把免疫球蛋白完整的抗體基因擴增出來，重組到原核表達載體中，并通過與噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白，使抗體片段表達于噬菌體表面，可以方便地利用不同抗原篩選相應(yīng)的抗體。這不僅是一種制備人源性抗體的有效方法，而且能夠制備具有大容量和多樣性的抗體庫，在獲得高親和力的抗體以及對抗體性能進行改造方面具有較強的優(yōu)勢。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使人們能夠在體外模擬體內(nèi)B細胞產(chǎn)生抗體的全過程，為人源抗體的制備提供了簡便而高效的可操作系統(tǒng)，因而具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。 本課題采用噬菌體抗體庫這一新興的生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建大容量天然人源Fab抗體庫： 首先，RT-PCR擴增抗體重鏈(Fd)和輕鏈(V_L+C_L)基因片段：從未經(jīng)主動免疫的健康志愿者和不同疾病患者外周血(約260ml)中獲得淋巴細胞，提取總RNA，電泳結(jié)果顯示完整性良好，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，根據(jù)免疫球蛋白可變區(qū)N端第一骨架區(qū)(FR1)DNA序列的相對保守性而設(shè)計的5′端引物及依據(jù)抗體J區(qū)基因序列而設(shè)計的3′端引物配對進行PCR，擴增抗體重鏈Fd基因和輕鏈基因，大小均為700bp左右。 其次，輕鏈PCR產(chǎn)物重組入噬粒載體pComb3XSS：輕鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化，與pComb3XSS分別以適量SacⅠ和XbaⅠ雙酶切后進行連接，電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL1-Blue，搖菌擴增提取質(zhì)粒。以適量轉(zhuǎn)化細菌菌液鋪板，隨機挑取10個克隆，提質(zhì)粒后以SacⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定目的片段V_L+C_L基因的插入效率。帶輕鏈插入段的pComb3XSS，命名為pComb3XSS+L。 最后，重鏈Fd段PCR產(chǎn)物重組入pComb3XSS+L，構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫，進行初步篩選：搖菌擴增后提取噬粒pComb3XSS+L，用XhoⅠ和SpeⅠ酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的重鏈Fd段PCR產(chǎn)物連接，電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞XL1-Blue，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13超感染，構(gòu)建非免疫人源Fab噬菌體抗體庫。隨機挑選10個克隆酶切鑒定，提質(zhì)粒后以XhoⅠ／SpeⅠ雙酶切，鑒定有無Fd片段的插入，經(jīng)SacⅠ／SpeⅠ酶切鑒定有無Fab的插入。得到的同時含F(xiàn)d片段和輕鏈基因的質(zhì)粒，命名為pComb3XSS(H+L)。 在成功構(gòu)建大容量天然人源Fab抗體庫基礎(chǔ)上，進行HAV特異性抗體的富集與淘選：包被純化的HAV全病毒抗原于酶標(biāo)板，3％BSA封閉，加人噬菌體抗體庫，對其進行兩輪篩選與富集，用HAV抗體診斷試劑盒對篩選結(jié)果進行測定。隨機提取1個克隆的重組質(zhì)粒，測定輕鏈(V_L+C_L)、重鏈(Fd)DNA序列并進行同源性分析。 本實驗成功構(gòu)建了庫容量為1.26×10~(11)pfu／ml的Fab噬菌體抗體庫，重組率為90％；測序結(jié)果顯示重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈恒定區(qū)同源性為92％，輕鏈核苷酸序列與λ鏈恒定區(qū)同源性為95％；輕、重鏈可變區(qū)序列屬VH1基因家族，IgG亞類；競爭性ELISA檢測(抗HAV單克隆抗體作為參照抗體)第二輪篩選得到的噬菌體抗體，實驗結(jié)果表明，噬菌體抗體能夠抑制HAV單克隆抗體與HAV的結(jié)合，其抑制率為38.61％。 本研究為分子生物學(xué)實驗方法的一個探索與嘗試。本課題的完成，，為今后篩選制備各種抗體提供了技術(shù)平臺和思路，希望為本研究室的后續(xù)研究提供技術(shù)及物質(zhì)支持。
[Abstract]:The emergence of antibody technology plays an important role in the development of medical science , and has been widely used in the diagnosis and treatment of diseases . Since the 1970s , Kohler and Milstein have succeeded in preparing hybridoma monoclonal antibodies ( McAb ) in the fields of disease diagnosis , treatment and prevention .


The phage antibody library technology is based on the technique of PCR and phage display technique . It is an effective way to obtain the human antibody molecule by constructing the phage antibody library . The technology uses polymerase chain reaction ( PCR ) to amplify the immunoglobulin complete antibody gene , and then the antibody fragment is expressed on the surface of the phage .


This subject uses phage antibody library as a new biological technique to construct a large capacity natural humanized Fab antibody library :


First , the fragments of the heavy chain and light chain ( V _ L + C _ L ) gene were amplified by RT - PCR : lymphocytes were obtained from the peripheral blood ( about 260 ml ) of healthy volunteers and patients with different diseases . The total RNA was extracted . The results showed that the integrity was good , the first strand of cDNA was synthesized , 5 ' - end primers designed according to the relative conserved nature of the DNA sequence of the N - terminal first framework region ( FR1 ) of the immunoglobulin variable region and the 3 ' - end primer designed according to the gene sequence of the antibody J region were used to amplify the heavy chain of the antibody and the light chain gene , and the size was about 700 bp .


Secondly , the light chain PCR products were recombined into the pComb3 XSS : light chain PCR products were isolated and purified , and then ligated with pComb3 XSS by appropriate amount of SacI and Xba 鈪

本文編號：1922481