本文選題：血液細胞 + 靶向　； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2006年碩士論文

【摘要】：目前基因轉運方法很多，其中包括物理方法、化學方法、融合法、基因槍等。上述基因轉移方法各有優(yōu)點，但共同問題是基因轉移效率低，較難獲得穩(wěn)定表達的細胞。腺病毒載體由于具有宿主范圍廣、能制備高滴度病毒、感染效率高、高表達目的基因、能感染增殖及靜止兩類細胞、不與宿主細胞基因組DNA結合、容許插入大片段外源基因等特點而受到人們的青睞。 多數(shù)用于基因轉移的腺病毒載體都來自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2)，，但很多血液系統(tǒng)來源的細胞對腺病毒感染具有天然的抵抗性，因此限制了該載體在造血研究領域的應用。腺病毒纖維蛋白在腺病毒黏附到靶細胞的過程中起關鍵作用，不同腺病毒亞型可能會具有不同的組織或細胞趨向性，因為它們的纖維蛋白會識別不同的細胞表面受體。血液細胞表面具有B組腺病毒Ad11p的高效結合受體，可以通過對5型腺病毒載體進行纖維改造，使其具有B組腺病毒的趨向性，從而增強對血液細胞的基因轉移效率。 本研究以AdEasy系統(tǒng)為基礎，先用遞歸PCR的方法人工合成人B組11p型腺病毒的部分纖維(fiber)基因，測序正確后，經(jīng)過多次的酶切連接操作，將其替換AdEasy骨架質粒中的人5型腺病毒的fiber基因，得到新的腺病毒骨架質粒命名為AdEasy-1／F11p，應用帶有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報告基因的穿梭質粒pShuttle-GFP與AdEasy-1／F11p腺病毒DNA在BJ5183細菌內進行同源重組得到重組腺病毒質粒，切取重組腺病毒基因組DNA，脂質體轉染法將其轉運到293包裝細胞內獲得重組腺病毒，命名為Ad5F11p-GFP。同時以GFP監(jiān)測腺病毒載體包裝、擴增及滴度測定。為了檢測改建后的重組腺病毒感染血液細胞的能力，以Ad5-GFP作對照，應用純化后的重組腺病毒感染白血病細胞系、原代白血病細胞以及臍帶血來源的CD34~+造血干細胞，流式細胞儀檢測GFP的表達。結果顯示這種改建后的重組腺病毒能靶向結合血液細胞，其轉染血液細胞的能力明顯提高，顯示出很好的應用前景。
[Abstract]:There are many methods of gene transport, including physical method, chemical method, fusion method, gene gun and so on. These methods have their own advantages, but the common problem is that the efficiency of gene transfer is low and it is difficult to obtain stable expression cells. Because of its wide host range, adenovirus vector can prepare high titer virus, high infection efficiency, high expression of target gene, can infect both proliferative and stationary cells, and does not bind to host cell genomic DNA. Allowing the insertion of large fragments of foreign genes and other characteristics are favored by people. Most of the adenovirus vectors used for gene transfer come from adenovirus type 5 or type 2 adenovirus, but many cells from blood system have natural resistance to adenovirus infection, so the application of adenovirus vector in hematopoietic research is limited. Adenovirus fibrin plays a key role in the process of adenovirus adhesion to target cells. Different adenovirus subtypes may have different tissue or cell tendency because their fibrin recognizes different cell surface receptors. The surface of blood cells has a highly efficient binding receptor of group B adenovirus Ad11p, which can be modified with the fiber of adenovirus type 5 to make it have the tendency of group B adenovirus, thus enhancing the efficiency of gene transfer to blood cells. In this study, based on AdEasy system, the human B group 11p adenovirus partial fiber-fibergene was synthesized by recursive PCR method. After correct sequencing, the gene was digested and ligated several times. To replace the fiber gene of human adenovirus type 5 in the AdEasy skeleton plasmid. A new adenovirus skeleton plasmid named AdEasy-1 / F11p was obtained. The recombinant adenovirus plasmid pShuttle-GFP and AdEasy-1/F11p adenovirus DNA were homologous recombined in BJ5183 bacteria by using the shuttle plasmid pShuttle-GFP with the green fluorescent protein fluorescence protein (GFP) reporter gene. The recombinant adenovirus DNA was digested and transferred into 293 packaging cells by liposome transfection to obtain the recombinant adenovirus named Ad5F11p-GFP. At the same time, GFP monitoring adenovirus vector packaging, amplification and titer determination. In order to test the ability of recombinant adenovirus to infect blood cells, the purified recombinant adenovirus was used to infect leukemia cell lines, primary leukemia cells and CD34 ~ hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood, using Ad5-GFP as control. The expression of GFP was detected by flow cytometry. The results showed that the recombinant adenovirus could target blood cells, and its ability to transfect blood cells was significantly improved, which showed a good prospect of application.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：1921198