發(fā)布時(shí)間：2018-05-22 08:01

  本文選題：血液細(xì)胞 + 靶向��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目前基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法很多，其中包括物理方法、化學(xué)方法、融合法、基因槍等。上述基因轉(zhuǎn)移方法各有優(yōu)點(diǎn)，但共同問(wèn)題是基因轉(zhuǎn)移效率低，較難獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。腺病毒載體由于具有宿主范圍廣、能制備高滴度病毒、感染效率高、高表達(dá)目的基因、能感染增殖及靜止兩類(lèi)細(xì)胞、不與宿主細(xì)胞基因組DNA結(jié)合、容許插入大片段外源基因等特點(diǎn)而受到人們的青睞。 多數(shù)用于基因轉(zhuǎn)移的腺病毒載體都來(lái)自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2)，，但很多血液系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞對(duì)腺病毒感染具有天然的抵抗性，因此限制了該載體在造血研究領(lǐng)域的應(yīng)用。腺病毒纖維蛋白在腺病毒黏附到靶細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，不同腺病毒亞型可能會(huì)具有不同的組織或細(xì)胞趨向性，因?yàn)樗鼈兊睦w維蛋白會(huì)識(shí)別不同的細(xì)胞表面受體。血液細(xì)胞表面具有B組腺病毒Ad11p的高效結(jié)合受體，可以通過(guò)對(duì)5型腺病毒載體進(jìn)行纖維改造，使其具有B組腺病毒的趨向性，從而增強(qiáng)對(duì)血液細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率。 本研究以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)，先用遞歸PCR的方法人工合成人B組11p型腺病毒的部分纖維(fiber)基因，測(cè)序正確后，經(jīng)過(guò)多次的酶切連接操作，將其替換AdEasy骨架質(zhì)粒中的人5型腺病毒的fiber基因，得到新的腺病毒骨架質(zhì)粒命名為AdEasy-1／F11p，應(yīng)用帶有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報(bào)告基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP與AdEasy-1／F11p腺病毒DNA在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組得到重組腺病毒質(zhì)粒，切取重組腺病毒基因組DNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)運(yùn)到293包裝細(xì)胞內(nèi)獲得重組腺病毒，命名為Ad5F11p-GFP。同時(shí)以GFP監(jiān)測(cè)腺病毒載體包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定。為了檢測(cè)改建后的重組腺病毒感染血液細(xì)胞的能力，以Ad5-GFP作對(duì)照，應(yīng)用純化后的重組腺病毒感染白血病細(xì)胞系、原代白血病細(xì)胞以及臍帶血來(lái)源的CD34~+造血干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)。結(jié)果顯示這種改建后的重組腺病毒能靶向結(jié)合血液細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染血液細(xì)胞的能力明顯提高，顯示出很好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:There are many methods of gene transport, including physical method, chemical method, fusion method, gene gun and so on. These methods have their own advantages, but the common problem is that the efficiency of gene transfer is low and it is difficult to obtain stable expression cells. Because of its wide host range, adenovirus vector can prepare high titer virus, high infection efficiency, high expression of target gene, can infect both proliferative and stationary cells, and does not bind to host cell genomic DNA. Allowing the insertion of large fragments of foreign genes and other characteristics are favored by people. Most of the adenovirus vectors used for gene transfer come from adenovirus type 5 or type 2 adenovirus, but many cells from blood system have natural resistance to adenovirus infection, so the application of adenovirus vector in hematopoietic research is limited. Adenovirus fibrin plays a key role in the process of adenovirus adhesion to target cells. Different adenovirus subtypes may have different tissue or cell tendency because their fibrin recognizes different cell surface receptors. The surface of blood cells has a highly efficient binding receptor of group B adenovirus Ad11p, which can be modified with the fiber of adenovirus type 5 to make it have the tendency of group B adenovirus, thus enhancing the efficiency of gene transfer to blood cells. In this study, based on AdEasy system, the human B group 11p adenovirus partial fiber-fibergene was synthesized by recursive PCR method. After correct sequencing, the gene was digested and ligated several times. To replace the fiber gene of human adenovirus type 5 in the AdEasy skeleton plasmid. A new adenovirus skeleton plasmid named AdEasy-1 / F11p was obtained. The recombinant adenovirus plasmid pShuttle-GFP and AdEasy-1/F11p adenovirus DNA were homologous recombined in BJ5183 bacteria by using the shuttle plasmid pShuttle-GFP with the green fluorescent protein fluorescence protein (GFP) reporter gene. The recombinant adenovirus DNA was digested and transferred into 293 packaging cells by liposome transfection to obtain the recombinant adenovirus named Ad5F11p-GFP. At the same time, GFP monitoring adenovirus vector packaging, amplification and titer determination. In order to test the ability of recombinant adenovirus to infect blood cells, the purified recombinant adenovirus was used to infect leukemia cell lines, primary leukemia cells and CD34 ~ hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood, using Ad5-GFP as control. The expression of GFP was detected by flow cytometry. The results showed that the recombinant adenovirus could target blood cells, and its ability to transfect blood cells was significantly improved, which showed a good prospect of application.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1921198