本文選題：HIV-1 + 艾滋病疫苗��； 參考：《北京工業(yè)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 近年來(lái)艾滋病毒,即人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)在世界范圍內(nèi)迅速傳播,尤其是在非洲,已經(jīng)成為死亡的首要病因。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織2006年11月21日共同發(fā)布的《2006年世界艾滋病報(bào)告》顯示,2006年全球新增艾滋病病毒感染者430萬(wàn),使艾滋病病毒感染者總數(shù)達(dá)3,950萬(wàn),同時(shí)全球又有290萬(wàn)人死于艾滋病。截至2006年10月31日,我國(guó)歷年累計(jì)報(bào)告HIV感染者183,733例,其中艾滋病病人40,667例,死亡12,464例。國(guó)際醫(yī)學(xué)界至今尚無(wú)治愈艾滋病的有效藥物和療法。因而研制針對(duì)我國(guó)HIV流行株的預(yù)防性和治療性疫苗迫在眉睫。 目前研制的預(yù)防性疫苗還不能產(chǎn)生針對(duì)HIV的持久免疫力,本研究的目的是構(gòu)建有效抑制HIV復(fù)制的治療性疫苗,有效后再用于預(yù)防。在經(jīng)過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療、病人血漿HIV病毒載量下降后,應(yīng)用該疫苗替代或減少化學(xué)藥物的應(yīng)用,從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制、減輕病情的作用。 本研究首先比較HIV-1 gag基因野生型(wt.gag)與密碼子優(yōu)化型(mod.gag)在體外細(xì)胞水平表達(dá)量,經(jīng)Western Blot證實(shí)mod.gag基因的表達(dá)水平明顯高于wt.gag基因。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用mod.gag構(gòu)建的重組病毒株。經(jīng)PCR,Western Blot,間接免疫熒光鑒定了密碼子優(yōu)化過(guò)的HIV-1 gag基因在重組腺病毒(rAd5/F35-mod.gag)的正確插入和體外細(xì)胞水平的表達(dá);用rAd5/F35-mod.gag以不同的方式單獨(dú)或與DNA,rAAV2/1聯(lián)合免疫BALB/c小鼠,ELISA檢測(cè)小鼠血清中的P24特異性抗體,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)小鼠特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。結(jié)果重組腺病毒rAd5/F35-mod.gag中g(shù)ag正確插入并且在體外細(xì)胞水平可以很好的表達(dá)目的基因gag;除PBS對(duì)照組外,在小鼠體內(nèi)rAd5/F35-mod.gag單獨(dú)或與DNA聯(lián)合免疫均可誘導(dǎo)特異性的CTL應(yīng)答和血清IgG抗體反應(yīng),單獨(dú)免疫rAd5/F35-mod.gag兩次分泌IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的8.828±1.554%,該組CTL反應(yīng)的效果優(yōu)于DNA初免,rAd5/F35-mod.gag加強(qiáng)的聯(lián)合免疫組(3.62±2.03%)。單獨(dú)免疫rAd5/F35-mod.gag組抗HIV-1 P24 IgG抗體滴度為1:12800,高于其他各組,反應(yīng)結(jié)果與細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果一致。 腺病毒5型(Ad5)在人群中的感染率較高,預(yù)先存在的抗體可能會(huì)降低腺病毒載體攜帶的目的基因在體內(nèi)的表達(dá)水平從而減弱其免疫原性。本研究通過(guò)改變Ad5型的纖突蛋白Fiber構(gòu)建了含有g(shù)ag基因的rAd5/F35-mod.gag載體,期望可以避免Ad5特異性免疫反應(yīng)的抑制作用。首先用Ad5-GFP免疫小鼠來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)Ad5的特異性免疫反應(yīng),再用rAd5/F35-mod.gag和rAd5-mod.gag免疫小鼠,檢測(cè)HIV-1 Gag特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Ad5-GFP初次感染4周后,rAd5/F35-mod.gag免疫2次后分泌IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的1.71±0.05%,低于rAd5/F35-mod.gag單獨(dú)免疫2次的特異性細(xì)胞免疫水平(4.34±3.27%);而rAd5 -mod.gag在預(yù)先存在Ad5特異性免疫反應(yīng)影響下,HIV特異性細(xì)胞免疫水平0.75±0.06%,遠(yuǎn)低于rAd5-mod.gag單獨(dú)免疫2次的細(xì)胞免疫水平(4.70±0.73%)。因此rAd35/F35受到預(yù)先存在Ad5特異性免疫反應(yīng)的抑制作用相對(duì)較小。因此重組腺病毒rAd5/F35-mod.gag只改變Ad5纖突蛋白Fiber,可以部分避免Ad5特異性免疫反應(yīng)的抑制作用。 上述結(jié)果表明rAd5/F35-mod.gag載體用做疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的HIV-1特異性細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),是一種有希望的HIV候選疫苗。
[Abstract]:In recent years, HIV, the human immunodeficiency virus (Human Immunodeficiency Virus, HIV), has spread rapidly worldwide, especially in Africa, which has become the leading cause of death. The United Nations Programme on AIDS and the World Health Organization (WHO) and the World Health Organization (WHO), jointly issued by the United Nations Programme on HIV / AIDS and the World Health Organization (WHO) November 21, 2006 World AIDS report, show that 2006 Global The total number of HIV infected people was 4 million 300 thousand, the total number of HIV infected people was 39 million 500 thousand, and 2 million 900 thousand people died of AIDS in the world. Up to October 31, 2006, there were 183733 cases of HIV infection in China, including 40667 cases of AIDS patients and 12464 deaths. There is no effective drug to cure AIDS in the international medical field. Therefore, it is urgent to develop preventive and therapeutic vaccines targeting HIV strains in China.
The present preventive vaccine can not produce persistent immunity against HIV. The aim of this study is to construct a therapeutic vaccine that effectively inhibits HIV replication and to be used for prevention. After antiretroviral therapy, the vaccine should be used to replace or reduce the use of chemical drugs after the decrease of HIV viral load in the plasma of the patients. It can inhibit the replication of the virus and reduce the effect of the disease.
In this study, the level of expression of HIV-1 gag gene wild type (wt.gag) and codon optimization (mod.gag) in vitro was compared. The expression level of mod.gag gene was obviously higher than that of wt.gag gene by Western Blot. Therefore, the recombinant virus strain constructed by mod.gag was used in the follow-up experiment. The indirect immunofluorescence was identified by PCR, Western Blot, and indirect immunofluorescence. The HIV-1 gag gene has been optimized by the symbol in the correct insertion of recombinant adenovirus (rAd5/F35-mod.gag) and the expression of the cell level in vitro; the specific anti body in the serum of the mice was detected by rAd5/F35-mod.gag in a different way or with DNA, rAAV2/1 combined with BALB/c mice, and ELISA was used to detect the specificity of the mouse serum. The intracellular cytokine staining method was used to detect the specificity of the mice. Cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. Results gag was correctly inserted in the recombinant adenovirus rAd5/F35-mod.gag and expressed the target gene gag well at the cell level in vitro. Except for the PBS control group, the rAd5/F35-mod.gag alone or combined with DNA in mice could induce specific CTL response and serum IgG antibody response, alone. The CD8+ T cells that immunized rAd5/F35-mod.gag two times IFN- gamma accounted for 8.828 + 1.554% of the total CD8+T cells. The effect of CTL reaction in this group was better than that of the primary DNA and the combined immune group (3.62 + 2.03%) strengthened with rAd5/F35-mod.gag. The anti HIV-1 P24 IgG antibody titer of the rAd5/F35-mod.gag group was 12800, which was higher than that of the other groups, and the reaction results and cellular immunity were higher than those in the other groups. The results of the reaction are consistent.
The infection rate of adenovirus type 5 (Ad5) is higher in the population. The pre existing antibody may reduce the expression level of the target gene in the adenovirus vector in vivo to weaken its immunogenicity. This study constructs the rAd5/F35-mod.gag vector containing the gag gene by changing the Ad5 type of the fibrinoid protein Fiber, hoping to avoid the specific Ad5 specificity. The inhibitory effect of sexual immune response. First, the specific immune response to Ad5 was induced by Ad5-GFP immunization in mice. The mice were immunized with rAd5/F35-mod.gag and rAd5-mod.gag to detect the HIV-1 Gag specific cellular immune response for 4 weeks after primary infection, and CD8+ T cells secreting IFN- gamma after rAd5/F35-mod.gag immunization for 2 times accounted for the total CD8+T cells. The 1.71 + 0.05%, lower than the specific immunization level of rAd5/F35-mod.gag alone (4.34 + 3.27%), and rAd5 -mod.gag in the pre existence of Ad5 specific immune response, the HIV specific cell immune level was 0.75 + 0.06%, far below the cellular immune level of 2 times alone (4.70 + 0.73%). Therefore, rAd35/F35 received. The inhibition of Ad5 specific immunoreaction in advance is relatively small. Therefore, the recombinant adenovirus rAd5/F35-mod.gag only changes the Ad5 fibrin protein Fiber, which can partly avoid the inhibitory effect of Ad5 specific immune response.
The above results show that rAd5/F35-mod.gag vector can induce strong and persistent HIV-1 specific cell and humoral immune response, which is a promising candidate for HIV vaccine.
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R373;R392

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