本文選題：EB病毒 + 潛伏膜蛋白2A(LM2A)��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： Epstein-Barr病毒(EBV)屬γ皰疹病毒亞科，在世界各地廣泛傳播，為95％成人所攜帶。EBV原發(fā)感染通常引起傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)，一旦感染將終身攜帶。EBV能感染人體內(nèi)的靜止性B淋巴細(xì)胞，部分感染細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞(LCL)建立潛伏感染。EBV攜帶者體內(nèi)存在著較強(qiáng)的特異性CTL，控制著EBV的潛伏感染，但不能清除病毒。宿主免疫功能低下時(shí)，感染的B細(xì)胞無限制增殖而發(fā)生轉(zhuǎn)化。目前已證實(shí)EBV與Burkitt’s淋巴瘤(BL)、霍奇金氏淋巴瘤(HD)和鼻咽癌(NPC)等的發(fā)生密切相關(guān)。鼻咽癌屬于EB病毒引起的一種最常見的非淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，全世界NPC病例80％發(fā)生于我國(guó)。鑒于鼻咽癌不能手術(shù)治療，而放療化療也不能有效清除腫瘤細(xì)胞，絕大多數(shù)病人易發(fā)生遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移，因此早期診斷和免疫治療顯得十分重要。 EB病毒與NPC的發(fā)生密切相關(guān)，通過檢測(cè)EBV的抗體早期診斷NPC是提高NPC患者存活率的一個(gè)重要的手段。隨著對(duì)EBV的血清流行病學(xué)的研究和分子生物學(xué)的發(fā)展，克隆、表達(dá)、純化EBV的蛋白或多肽，并以此為抗原建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏和特異的檢測(cè)EBV抗體的方法是目前研究NPC診斷的主要發(fā)展方向。EB病毒潛伏膜蛋白2A(LMP2A)能穩(wěn)定表達(dá)于一些EBV相關(guān)腫瘤的細(xì)胞膜上，與病毒的潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，并參與調(diào)節(jié)跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其功能日益受到重視。 本研究用重疊PCR方法得到包含LMP2A四個(gè)主要抗原表位的基因序列，該重組基因命名為EC2A，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-EC2A，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)并純化；以純化的融合蛋白為抗原免疫小鼠制備單克隆抗體并鑒定；初步應(yīng)用純化的蛋白來進(jìn)行EB病毒相關(guān)鼻咽癌病人的血清學(xué)檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 一、EB病毒LMP2A多表位重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 運(yùn)用軟件對(duì)LMP2A編碼基因序列進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)其可能的抗原表位。經(jīng)重疊PCR得到包含LMP2A四個(gè)主要抗原表位的基因序列，重組基因命名為EC2A。構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-EC2A。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定、核酸序列測(cè)定和分析后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Ecoli)BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白用鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白分子量約為40kD。 二、EB病毒LMP2A多表位融合蛋白單克隆抗體的制備與鑒定 以純化的融合蛋白為抗原免疫小鼠，按常規(guī)方法融合，經(jīng)反復(fù)克隆及亞克隆后得到一株能穩(wěn)定分泌鼠抗人LMP2A單克隆抗體，命名為1F5。采用腹水誘生的方法進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)，抗體腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法初步純化后濃度為10mg／ml。經(jīng)快速定性試紙法鑒定1F5的重鏈為IgG1，輕鏈為κ。ELISA法分析表明，純化后單抗的效價(jià)為1：10000以上。Western blot分析結(jié)果顯示這株單抗具有良好的識(shí)別LMP2A分子的特異性。 三、EB病毒LMP2A多表位融合蛋白在鼻咽癌血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用 以純化的蛋白作為抗原，用ELISA法檢測(cè)EB病毒相關(guān)鼻咽癌病人的血清中的抗體，結(jié)果顯示檢出率為84.4％。此方法與常規(guī)VCA／IgA法比較，敏感性略高。此方法有望為臨床NPC早期診斷增添一種方法。 綜上所述，本研究成功克隆了包含LMP2A四個(gè)主要抗原表位的基因序列EC2A并在大腸桿菌中表達(dá)，用純化的融合蛋白制備了一株單克隆抗體，，并將此蛋白初步運(yùn)用于NPC病人的血清學(xué)檢測(cè)，顯示其能檢測(cè)到特異性的抗體。本實(shí)驗(yàn)為今后研究LMP2A的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)，以此為抗原也有望應(yīng)用于臨床檢測(cè)。
[Abstract]:Epstein - Barr virus ( EBV ) is a kind of 緯 - Herpesviridae , widely distributed around the world , and is carried by 95 % of adults . EBV infection usually causes infectious mononucleosis ( IM ) . EBV infection can be transformed into lymphoblasts .






EBV latent membrane protein 2A ( LMP2A ) can be stably expressed on the cell membrane of some EBV - related tumors , closely related to latent infection of virus and cell transformation , and is involved in regulating the transduction of transmembrane signal .






The gene sequence of four major epitopes of LMP2A was obtained by overlapping PCR . The recombinant gene was named EC2A , the prokaryotic expression plasmid pET32a - EC2A was constructed and transformed into E . coli .
preparing a monoclonal antibody by immunizing a mouse with purified fusion protein as an antigen and identifying ;
Preliminary application of purified proteins for serological detection of EBV - related nasopharyngeal carcinoma patients . The main research contents and results are as follows :






Expression and Purification of One , Epstein - Barr Virus LMP2A Multiepitope Recombinant Gene in Escherichia coli






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本文編號(hào)：1893577