本文選題：RNA干擾 + 神經(jīng)病理疼痛��； 參考：《中南大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 疼痛是一種與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)聯(lián)的不愉快的感覺和情感體驗(yàn),是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng),是臨床上最常見的癥狀之一,也是促使人們就醫(yī)的最常見原因之一。慢性疼痛不僅僅是一種癥狀,也可以是一種疾病。任何人一生中都難免要遭受疼痛的折磨。全世界有三分之一以上的人正在不同程度地遭受著慢性疼痛的折磨,嚴(yán)重影響了工作、學(xué)習(xí)和生活。疼痛不會(huì)導(dǎo)致直接患者死亡,但有些患者因?yàn)槿淌懿涣碎L(zhǎng)時(shí)間的嚴(yán)重慢性疼痛而產(chǎn)生自殺的念頭,甚至采取自殺行為。麻醉性鎮(zhèn)痛藥和非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥仍然是目前疼痛治療的最主要藥物,但這些藥物特異性不高,療效并不理想,而且長(zhǎng)期使用可以引起藥物依賴、呼吸抑制、胃腸道損傷等嚴(yán)重副作用,相當(dāng)一部分病人不得不停止使用。頑固性癌痛和神經(jīng)病理性疼痛的治療是臨床醫(yī)師面臨的棘手課題,神經(jīng)病理性疼痛一般對(duì)阿片類藥物不敏感,抗抑郁藥和抗癲癇藥治療神經(jīng)病理學(xué)疼痛的療效不佳。因此,國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者在不斷地探究疼痛產(chǎn)生的病理生理機(jī)制,尋求疼痛治療的新技術(shù)和新方法。 轉(zhuǎn)錄因子下游調(diào)控元件的拮抗分子(Downstream regulatoryelement antagonist modulator,DREAM)是痛覺處理過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制子之一,DREAM與前腦啡肽原基因(preprodynorphin,PPD)的DRE(Downstream regulatory element)位點(diǎn)結(jié)合,抑制PPD基因表達(dá)而發(fā)揮作用。DREAM痛覺調(diào)節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)為疼痛治療提供了嶄新的研究靶點(diǎn),我們可以通過(guò)阻斷DREAM基因,解除其對(duì)PPD基因表達(dá)抑制,激活內(nèi)源性強(qiáng)啡肽/κ受體鎮(zhèn)痛系統(tǒng),發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和RNA干擾技術(shù)的不斷完善,RNAi已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。RNAi具有高度特異性和高效性,并有強(qiáng)大的細(xì)胞穿透能力,可在細(xì)胞間傳遞,甚至遺傳給子代等特點(diǎn)。RNA干擾是研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的新技術(shù),是一種快捷高效、特異性強(qiáng)的抑制基因表達(dá)的工具。近年來(lái)有人將RNAi技術(shù)用于疼痛治療實(shí)驗(yàn)研究取得成功。如2004年Dorn等將他們將化學(xué)合成的針對(duì)P2X3的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)經(jīng)鞘內(nèi)注入,顯著減輕了大鼠神經(jīng)病理性疼痛,不伴有明顯的毒性反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。提示RNAi技術(shù)用于疼痛的基因治療是可行的。 本研究的目的是利用RNA干擾技術(shù)抑制DREAM基因表達(dá),開展對(duì)神經(jīng)病理性疼痛基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。整個(gè)研究分三部分進(jìn)行,第一部分觀察設(shè)計(jì)的針對(duì)DREAM基因的SiRNA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的RNA干擾效應(yīng),確定針對(duì)DREAM基因進(jìn)行RNA干擾的有效作用位點(diǎn),為后續(xù)的慢病毒載體的構(gòu)建及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。利用在線網(wǎng)站的生物軟件設(shè)計(jì)多個(gè)DREAM基因的RNA干擾序列,構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒,然后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,通過(guò)熒光顯微鏡觀察、Realtime-PCR測(cè)定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測(cè)定DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應(yīng)。結(jié)果顯示針對(duì)示針對(duì)DREAM基因設(shè)計(jì)了3條SiDREAM序列并構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率為85%,其中siRNA表達(dá)載體pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ使DREAM基因mRNA分別下調(diào)59%和47%,DREAM蛋白的表達(dá)亦明顯降低。第二部分是針對(duì)DREAM基因有效的RNA干擾作用位點(diǎn)構(gòu)建能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的慢病毒載體。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)篩選出的有效的siRNA序列設(shè)計(jì)合成適當(dāng)?shù)囊?重組到慢病毒穿梭質(zhì)粒中,將重組質(zhì)粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝出復(fù)制缺陷的慢病毒顆粒,并進(jìn)行載體病毒滴度的測(cè)定。結(jié)果成功構(gòu)建了慢病毒質(zhì)粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM,測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列完全一致,將質(zhì)粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得滴度為1.0×10~8 ifu/ml慢病毒顆粒。第三部分是將攜帶有siDREAM的慢病毒顆粒注入大鼠體內(nèi),研究siDREAM的RNA干擾效應(yīng),為以后臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。將純種健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠36只,隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(N)、假手術(shù)組(S),根據(jù)干預(yù)手段的不同將CCI疼痛模型組分為4組:CCI組(CO組),CCI疼痛模型建立后不給任何干預(yù)措施,觀察術(shù)后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學(xué)的改變。生理鹽水對(duì)照組(C1組),空白載體對(duì)照組(C2組),pKCSHR-puro/GFP-DREAM治療組(C3組)。該三組大鼠于CCI后第7天分別于蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水、空白載體、pKCSHR-puro/GFP-DREAM病毒載體,觀察各組術(shù)后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學(xué)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取腰段脊髓進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)GFP(綠色熒光蛋白)的表達(dá),Realtime-PCR測(cè)定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測(cè)定DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒載體后,CCI大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾的異常明顯得到改善,腰段脊髓神經(jīng)細(xì)胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。 本研究所得到的結(jié)論如下:1.成功構(gòu)建了針對(duì)DREAM基因特異性siRNA表達(dá)載體,在體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生針對(duì)DREAM基因特異性的RNA干擾效應(yīng),并確定了最佳作用位點(diǎn)為536～555。2.成功構(gòu)建了表達(dá)siDREAM的慢病毒質(zhì)粒載體—pKCSHR-Puro/GFP-DREAM,并與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得了滴度高達(dá)1.0×10~8 ifu/ml慢病毒顆粒。3.鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆�？筛咝мD(zhuǎn)染到大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),能夠有效改善CCI大鼠痛覺異常,初步證實(shí)具有鎮(zhèn)痛效應(yīng),為疼痛的基因治療提供了新的思路。4.鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆�？墒勾笫笱渭顾鑳�(nèi)DREAM基因mRNA表達(dá)下調(diào),DREAM蛋白表達(dá)降低,提示pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆粒在大鼠活體內(nèi)發(fā)揮了RNA干擾作用。
[Abstract]:Pain is an unpleasant feeling and emotional experience associated with actual or potential tissue damage , and is one of the most common causes of pain . Chronic pain is not only a symptom , but also a disease . Chronic pain is not only a symptom , but also a disease . The pain does not result in the death of a direct patient . However , some patients are suffering from a long - term use of drug - insensitive , anti - depressant , and anti - epileptic drugs for the treatment of neuropathic pain .


DREAM plays a role in inhibiting the expression of PPD gene . DREAM plays a role in inhibiting the expression of PPD gene .


RNA interference ( RNAi ) has become one of the hot topics in the field of life sciences research . RNAi has become one of the hot topics in the field of life science research . RNA interference is a tool for studying gene expression , regulation and function . In recent years , RNAi has been used to study the expression , regulation and function of biological genes .


The results showed that the siRNA expression vector pRNAT - DREAM - 鈪，

本文編號(hào)：1884915