本文選題：乙型腦炎病毒 + E蛋白　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 流行性乙型腦炎簡稱乙腦,是由乙腦病毒(也稱日本腦炎病毒,Japanese encephalitis virus,JEV)引起、由蚊蟲傳播的一種急性病毒性傳染病,主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng),對人類健康威脅很大。WHO估計(jì),目前乙腦每年發(fā)病約50000例,其中約1/3的病例死亡,且乙腦后遺癥嚴(yán)重,存活者20%~40%留有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴(yán)重后遺癥,給家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。近幾年我國乙腦報告病例數(shù)每年在5000～10000例之間,病死率約5%-35%,且有15%的幸存者可發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)精神后遺癥。盡管目前對JEV的分子生物學(xué)、免疫學(xué)特性的研究和乙腦的臨床救治等取得了很大的進(jìn)展,疫苗的應(yīng)用也使乙腦的發(fā)病率有所下降,但是關(guān)于JEV感染的分子機(jī)制還不完全清楚。 病毒受體決定了病毒的宿主范圍、組織及細(xì)胞親嗜性,并影響其致病性。一般認(rèn)為JEV囊膜糖蛋白E是該病毒的受體結(jié)合蛋白(VAP),能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的膜融合。研究發(fā)現(xiàn)E蛋白抗原決定簇分為三個區(qū),即結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ。其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ被認(rèn)為具有中和與血凝活性的表位,而結(jié)構(gòu)域Ⅲ是受體的主要結(jié)合部位,能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的膜融合。 本研究利用大腸埃希菌表達(dá)了JEV的E蛋白和E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ,還構(gòu)建了以JEV的E蛋白為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng),為進(jìn)一步研究JEV E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特別是與其受體蛋白的相互作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 1.JEV E蛋白的原核表達(dá)及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA,采用特異性引物擴(kuò)增出JEV E蛋白基因。將E基因克隆到pMD18-T載體中,經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后,再將該基因克隆到表達(dá)載體pET28a中,并轉(zhuǎn)化E. coli后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明,在相對分子質(zhì)量約53kDa處有明顯的條帶,與預(yù)期的6His-E融和蛋白大小一致;表達(dá)蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40%。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進(jìn)行純化,獲得了純化的JEV E蛋白。Western blot分析結(jié)果表明,表達(dá)的JEV E蛋白較好地保持了與抗JEV mAb和多抗的結(jié)合活性。 2.JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達(dá)及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA,采用特異性引物擴(kuò)增出JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因。將結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因克隆到pMD18-T載體中,經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后,再將該基因克隆到表達(dá)載體pET32a中,并轉(zhuǎn)化E. coli后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明,在相對分子質(zhì)量約20kDa處有明顯的條帶,與預(yù)期的6His-E-Ⅲ融和蛋白大小一致;表達(dá)蛋白約50%以包涵體形體存在于沉淀中,50%以可溶性形式存在于上清中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40%。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進(jìn)行純化,獲得了純化的JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ蛋白。采用抗his mAb進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果表明,表達(dá)的該融合蛋白較好地保持了與抗體的結(jié)合活性。 3.JEV E蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及其對報告基因激活作用的檢測將JEV E蛋白基因片段克隆入載體pUC19中,經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后,再將該基因克隆到表達(dá)載體pGBKT7中,并轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109,獲得了以JEV E為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)。檢測該系統(tǒng)中JEV E對酵母細(xì)胞有無毒性作用及對報告基因有無激活作用。結(jié)果表明,帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的AH109酵母菌在His營養(yǎng)缺陷的SD培養(yǎng)基上不生長,表明構(gòu)建的JEV E蛋白對His3基因無激活作用;β-半乳糖苷酶印膜法及平板法檢測結(jié)果也表明構(gòu)建的JEV E蛋白對Lac Z基因也不具有激活作用,且對AH109無毒性。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)獲得的JEV E蛋白、E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ以及以JEV的E蛋白為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng),可用于JEV E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及與其受體蛋白相互作用的研究。
[Abstract]:Japanese encephalitis virus , Japanese encephalitis virus ( JEV ) , is a kind of acute viral infectious disease which is caused by encephalitis virus ( Japanese encephalitis virus , Japanese encephalitis virus , JEV ) .





The virus receptors determine the host range , tissue and cell tropism of the virus , and influence its pathogenicity . It is generally believed that the JEV envelope glycoprotein E is the receptor binding protein of the virus , which can mediate the membrane fusion of the virus and the cell . It is found that the E protein antigenic determinant is divided into three regions , namely domain I , domain II and domain III . The domain II is considered to have neutralizing and blood coagulation activity epitopes , and the domain III is the main binding site of the receptor , which can mediate the membrane fusion of the virus and the cell .





In this study , the E - protein and E - protein domain 鈪，

本文編號：1844980