本文選題：漢坦病毒 + 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)　； 參考：《山東大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 漢坦病毒(hantavirus，HV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬。在臨床上引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)。漢坦病毒共有30多種基因型和血清型，但中國(guó)目前為止僅發(fā)現(xiàn)漢灘型(Hantaan，HTN)、漢城型(Seoul，SEO)和普馬拉型(Puumala，PUU)，均為HFRS的病原體。 HFRS臨床上以發(fā)熱、出血和腎損害為主要特征，它包括朝鮮出血熱、流行性出血熱和流行性腎病，每年在歐洲和亞洲有近10萬(wàn)病例發(fā)生。較早的報(bào)道可追溯到蘇聯(lián)在1913和1932年，日本軍隊(duì)1932年在滿洲里，瑞典在1934年的暴發(fā)流行。自從1978年李鎬汪等從疫區(qū)的黑線姬鼠肺組織中分離到漢坦病毒76-118株以來(lái)，各國(guó)學(xué)者相繼分離到不同型別的漢坦病毒。引起HFRS的漢坦病毒包括HTN型、SEO型、多不拉伐—貝爾格萊德型(Dobrava，DOB)和PUU型，分別引起重度、中度和輕度的臨床癥狀。 1993年HPS首先在美國(guó)的四角地區(qū)暴發(fā)，臨床上早期出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)等前驅(qū)癥狀，然后是突發(fā)性的呼吸困難，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡，病死率高，震驚了美國(guó)的公共衛(wèi)生官員和病毒學(xué)家。研究表明該病毒病原為SN型漢坦病毒，由鹿鼠攜帶，隨后又從不同地區(qū)的HPS病人體內(nèi)分離到NY、BCC、BAY、AND等不同型別漢坦病毒。在我國(guó)尚未有HPS病例的報(bào)道。 各種鼠類(lèi)是漢坦病毒重要的宿主和傳染源，他們各自攜帶不同的型別漢坦病毒。攜帶HTNV的黑線姬鼠主要在東亞和東歐，攜帶DOBV的黃頸喉姬鼠出現(xiàn)在南斯拉夫及鄰近地區(qū)，攜帶PUUV的歐洲棕背鼠存在于西北歐地區(qū)，而由褐家鼠攜帶的SEOV在世界范圍內(nèi)廣泛存在。 漢坦病毒引起的HFRS在我國(guó)發(fā)病率高，是重點(diǎn)防治的傳染病之一。中國(guó)HFRS病人總數(shù)占世界發(fā)病人數(shù)的90％以上，每年新發(fā)病例數(shù)4～6萬(wàn)。而山東省是HFRS的高發(fā)省份，年發(fā)病人數(shù)在我國(guó)常年位于前3位，2003年前則為全國(guó)第一位。山東省已發(fā)病例數(shù)占全國(guó)總病例數(shù)的1／3�？梢�(jiàn)山東省防治HFRS的工作具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義。山東引起HFRS的漢坦病毒以SEO型為主，也有HTN病毒存在，是混合疫區(qū)。對(duì)HFRS的診斷和防治歸根結(jié)底取決于對(duì)其病原學(xué)的研究進(jìn)展，包括病毒分離、病毒基因及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的研究、分子流行病學(xué)、新型疫苗、新型診斷試劑的研究與開(kāi)發(fā)等，其中對(duì)漢坦病毒的基因進(jìn)行分析和分子流行病學(xué)研究又是最根本和最基礎(chǔ)的研究。而山東省分離全片段測(cè)序的病毒株太少，對(duì)它們的分子生物學(xué)性質(zhì)尚缺乏深入研究。 漢坦病毒顆粒為圓形或卵圓形，外層是包膜，表面有突起，由G1和G2糖蛋白(glycoprotein，GP)組成。包膜內(nèi)為病毒核酸、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和RNA聚合酶組成的核衣殼，病毒體中核衣殼蛋白成分很高。病毒基因組為單股負(fù)鏈RNA，由長(zhǎng)(L)、中(M)、短(S)三個(gè)節(jié)段組成，分別編碼依賴RNA的RNA多聚酶，G1和G2包膜糖蛋白和核衣殼蛋白。 G1、G2包膜糖蛋白對(duì)病毒的致病性起重要作用，包含了病毒的中和抗原位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、融合肽和血凝位點(diǎn)。M片段中G1、G2的編碼順序?yàn)镹H_2-G1-G2-COOH。M片段首先編碼產(chǎn)生一個(gè)126 kD的糖蛋白前體(glycoprotein precursor，GPC)，然后在翻譯的同時(shí)被細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)肽酶切割成G1、G2兩個(gè)蛋白，組成異二聚體表達(dá)在內(nèi)膜系統(tǒng)，部分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，切割位點(diǎn)為一段絕對(duì)保守的WAASA的氨基酸序列。G1、G2共表達(dá)是二者在胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)運(yùn)和行使功能的基礎(chǔ)。G1、G2富含半胱氨酸殘基，維持了異源二聚體在內(nèi)膜系統(tǒng)管腔內(nèi)高度有序的空間結(jié)構(gòu)。G1、G2蛋白共有5～7個(gè)N—連糖基化位點(diǎn)，在二聚體蛋白的正確折疊中起一定作用。G1、G2蛋白N-端都有典型的信號(hào)肽序列，C-端為跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，但至今尚未能確定G1蛋白的C-端的真正構(gòu)成，因?yàn)镠V的G1蛋白C-端在胞內(nèi)容易被蛋白酶降解，這也成為細(xì)胞中糖蛋白表達(dá)水平低的原因之一。病毒的糖蛋白在高爾基體膜表面累積成熟后，包裹由N蛋白和基因組RNA形成的核衣殼，在高爾基體膜上出芽，通過(guò)內(nèi)膜系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)釋放到胞外。M片段基因的變異速度是三個(gè)節(jié)段中最快的，是決定HV毒力的主要因素。 HV的核衣殼蛋白在感染的細(xì)胞中高度表達(dá)，形成大顆粒狀或絲狀的包涵體，在包裹病毒基因組RNA、組裝病毒顆粒中起重要作用。核衣殼蛋白的氨基酸序列較為保守，其免疫原性很強(qiáng)。其N(xiāo)-端的氨基酸主要是親水性的，具有高度的抗原保守性，幾乎所有的人類(lèi)HV血清抗體都能識(shí)別此區(qū)；中間部分主要是親水性區(qū)域，在不同的HV中變異較大，含有RNA結(jié)合部位。C-端則較為保守。核蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體效價(jià)比G1、G2糖蛋白高。HFPS病人血清中抗核蛋白抗體出現(xiàn)最早，1周后，幾乎所有病人的抗核蛋白抗體均為陽(yáng)性。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)，體外獲得核蛋白的工程蛋白，并在此基礎(chǔ)上建立新的血清學(xué)方法，是新型診斷試劑研究的熱點(diǎn)之一。 HV的膜融合方式為pH依賴型，即HV先以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞后，在胞內(nèi)體低pH值環(huán)境下，包膜糖蛋白G1、G2結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出內(nèi)部融合肽，從而觸發(fā)融合。國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后證明了體外培養(yǎng)的不同類(lèi)型的HV病毒株在酸性條件下都能引起Vero E6細(xì)胞的融合。HTN型HV致細(xì)胞融合作用的是包膜糖蛋白G1、G2，NP的共表達(dá)與否不會(huì)增減G1、G2的融合活性。在傳代細(xì)胞株中，僅有40代以內(nèi)的Vero E6細(xì)胞可以在HV感染后或重組表達(dá)G1、G2后產(chǎn)生細(xì)胞融合現(xiàn)象，而B(niǎo)HK-21、Vero細(xì)胞和過(guò)度傳代(＞150)的Vero E6細(xì)胞則不會(huì)產(chǎn)生融合。目前尚沒(méi)有確定SEO型HV糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)是否能夠引起細(xì)胞融合現(xiàn)象的產(chǎn)生。細(xì)胞融合作用是多種病毒增殖、擴(kuò)散和致病過(guò)程中不可缺少的一步，因此對(duì)漢坦病毒膜融合的研究具有廣泛的意義。 本研究構(gòu)建了漢坦病毒ZB8株M片段和JUN5-14株S片段的克隆載體，測(cè)定了基因序列，研究了山東分離的漢坦病毒毒株的遺傳和變異的分子水平特點(diǎn)；通過(guò)M和S片段對(duì)山東分離的漢坦病毒毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析，闡述漢坦病毒，尤其是山東株的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，了解HV的變異規(guī)律，為進(jìn)一步采取免疫和預(yù)防措施提供理論基礎(chǔ)；將NP基因在BHK21細(xì)胞上做瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)其表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了研究，并觀察其做為底物檢測(cè)流行性出血熱病人血清中抗體的效果；構(gòu)建了NP基因的酵母表達(dá)載體，并讓其在畢赤酵母中得到穩(wěn)定表達(dá)，檢測(cè)表達(dá)特點(diǎn)，為構(gòu)建以重組NP為底物的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)；構(gòu)建糖蛋白基因的真核表達(dá)載體，并使糖蛋白基因在Vero E6細(xì)胞中表達(dá)，觀察其細(xì)胞融合現(xiàn)象，為糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究、研制漢坦病毒基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。 一、山東株M和S片段的基因克隆和序列分析 本研究為避免病毒在細(xì)胞傳代引起的突變，直接從漢坦病毒感染鼠的鼠肺標(biāo)本中，提取病毒RNA，根據(jù)SEO型HV的核苷酸序列及相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR的方法，擴(kuò)增出ZB8株HV全M片段和JUN5-14株HV S片段的NP全編碼序列。并將PCR擴(kuò)增片段連接T載體，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。酶切結(jié)果鑒定正確。測(cè)序后證實(shí)為SEO型HV序列。M和S片段的克隆，為研制新型診斷試劑，開(kāi)發(fā)基因工程疫苗，以及結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 我們對(duì)獲得的M和S片段序列特征進(jìn)行了分析。ZB8株的M片段基因序列測(cè)定長(zhǎng)度為3651bp，其中A堿基1107個(gè)，T堿基1097個(gè)，C堿基682個(gè)，G堿基765個(gè)，GC含量為39.6％。開(kāi)放性閱讀框架(open reading frame，ORF)的位置位于47～3448 bp，編碼由1133個(gè)氨基酸組成的包膜糖蛋白前體。JUN5-14株的S片段編碼區(qū)基因序列測(cè)定長(zhǎng)1290bp，其中A堿基403個(gè)，T堿基292個(gè)，C堿基257個(gè)，G堿基338個(gè)，GC含量為46.1％。編碼由429個(gè)氨基酸組成的NP。我們還利用TmPred和DNAStar等軟件預(yù)測(cè)了GP和NP的跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及其他蛋白質(zhì)信息。 我們使用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中國(guó)內(nèi)外病毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行了同源性分析。結(jié)果表明，JUN5-14株S片段的核苷酸序列與SEO型的各毒株的同源性在87.6～97.8％之間；ZB8株M片段的核苷酸序列與SEO型的各毒株的同源性在84.1～99.0％之間；M片段3′N(xiāo)CR的核苷酸序列是整個(gè)M片段中變異最頻繁的部位，而5′N(xiāo)CR的核苷酸序列是最為保守的。雖然JUN5-14和ZB8與SEO其他各株的核苷酸序列相比變異較大，但是其氨基酸序列高度保守，，同源性分別高達(dá)98.1～99.8％和96.9～99.6％之間。 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析表明：山東株JUN5-14和ZB8株均屬于SEO病毒第三亞型。與浙江分離株(Z37、ZT10、ZT71、Zy27)，北京分離株BiHD01，以及河北分離株93HBX12序列相近。其中在基于M片斷序列的發(fā)生樹(shù)上，ZB8株與山東GM04-38株親緣關(guān)系最近。序列分析研究探討了山東HV變異規(guī)律，為檢測(cè)和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依據(jù)。 二、漢坦病毒JUN5-14株NP基因在BHK21細(xì)胞中的表達(dá)和重組NP的抗原性分析 本研究通過(guò)基因克隆的方法，以質(zhì)粒pUCm-S為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增出NP的全長(zhǎng)基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，重組入質(zhì)粒pBluscriptⅡSK~+載體的T7啟動(dòng)子下游。酶切和測(cè)序鑒定正確，重組載體稱(chēng)為pBSK-NP。 將重組載體轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞中，表達(dá)2～3天后，用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay，IFA)與SDS-PAGE和免疫印記觀察蛋白的表達(dá)情況。IFA結(jié)果顯示NP基因在BHK21細(xì)胞中得到了表達(dá)，在細(xì)胞中呈核周分布。SDS-PAGE和免疫印記也在48kD分子量處觀察到了陽(yáng)性條帶。蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能與抗?jié)h坦病毒特異性抗體發(fā)應(yīng)。 在IFA實(shí)驗(yàn)中，我們用重組蛋白，檢測(cè)了17份HFRS病人血清和20份正常對(duì)照血清，結(jié)果顯示該法檢測(cè)血清抗體的敏感性為94.1％，特異性高達(dá)100％。證明了JUN5-14株NP是良好的診斷用靶抗原，為NP功能的研究，以及下一步NP基因的穩(wěn)定表達(dá)和診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。 三、漢坦病毒JUN5-14株NP基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和抗原性分析 以質(zhì)粒pUCm-S為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增NP的全長(zhǎng)基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。NP基因與pGAPZαA載體均經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)Zeocin篩選并測(cè)序，建立了表達(dá)載體pGAPZ-NP，并酶切、測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示雙酶切出現(xiàn)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段，測(cè)序證實(shí)NP基因無(wú)任何突變，插入了表達(dá)載體啟動(dòng)子下游，并與上游信號(hào)肽序列和下游C-Myc和His6序列編碼框融合。 NP基因的表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ-NP經(jīng)AvrⅡ線性化后用LiCl法轉(zhuǎn)化酵母菌，在YPD(含100μg／ml Zeocin)平板上兩次篩選，挑出單菌落，于液體YPD中培養(yǎng)，并在不同時(shí)點(diǎn)收集培養(yǎng)物，用SDS-PAGE和Western-blot進(jìn)行分析。SDS-PAGE分析顯示NP基因在畢赤酵母中得到高效穩(wěn)定表達(dá)，在48h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，之后趨于穩(wěn)定，上清和細(xì)胞中均有蛋白表達(dá)。Western-blot分析結(jié)果表明上清和細(xì)胞中的重組NP都能與抗HV的陽(yáng)性血清反應(yīng)。證明所表達(dá)的NP一部分在信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌出細(xì)胞外，并經(jīng)過(guò)折疊形成了正確的構(gòu)象。提示NP基因在酵母菌中成功表達(dá)，且免疫反應(yīng)性良好，為血清學(xué)診斷的研制奠定基礎(chǔ)。 四、糖蛋白基因的瞬時(shí)表達(dá) 本研究采用PCR和基因克隆技術(shù)，將ZB8株G1、G2基因分別克隆到表達(dá)載體pCAGGS／MCS，酶切和測(cè)序鑒定正確后，將表達(dá)載體pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，酸性MEM處理后觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的產(chǎn)生。并以IFA觀察糖蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示在Vero E6細(xì)胞中成功表達(dá)出糖蛋白G1、G2，IFA顯示熒光信號(hào)分布在細(xì)胞漿中。二者的共表達(dá)可以產(chǎn)生良好的生物學(xué)活性，在酸性條件下引起Vero E6細(xì)胞發(fā)生融合，而轉(zhuǎn)染pCAGGS-NP的細(xì)胞沒(méi)有融合現(xiàn)象發(fā)生。共表達(dá)也未出現(xiàn)明顯的促進(jìn)效應(yīng)。本研究首次從基因水平證實(shí)了SEO型HV產(chǎn)生細(xì)胞融合現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)存在于糖蛋白G1和G2中，為糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究，制備有效的亞單位疫苗奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有漢坦病毒ZB8株全M片段核苷酸序列的克隆以及JUN5-14株全S片段編碼區(qū)的克隆。兩株病毒均是SEO型漢坦病毒，為第三亞型。表達(dá)載體pBSK-NP能在感染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞內(nèi)有效地表達(dá)出NP，蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，在IFA實(shí)驗(yàn)中用來(lái)檢測(cè)血清抗體的敏感性和特異性均比較高，是良好的診斷用靶抗原。成功構(gòu)建了含有HV NP全基因的酵母表達(dá)載體，所表達(dá)的蛋白免疫反應(yīng)性良好。在Vero E6細(xì)胞中成功表達(dá)出糖蛋白G1、G2，二者的共表達(dá)可以產(chǎn)生良好的生物學(xué)活性，在酸性條件下引起Vero E6細(xì)胞發(fā)生融合。本課題為闡明SEO型HV的遺傳和變異規(guī)律，檢測(cè)和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依據(jù)，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)新型HV診斷試劑創(chuàng)造了有利條件，并且為進(jìn)一步研究GP的結(jié)構(gòu)與功能，制備有效的亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1842675