發(fā)布時(shí)間：2018-05-01 20:06

  本文選題：重癥肌無(wú)力 + 單鏈抗體��； 參考：《延邊大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：將抗乙酰膽堿受體單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)基因轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，制備單鏈抗體蛋白。方法：從Ecoli．DH5α中提取目的基因并純化，將電泳檢查后確認(rèn)正確的pPIC9K重組載體經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶Sal I線性化處理，電穿孔導(dǎo)入甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母GS115中，，提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR，檢測(cè)外源基因的插入情況。挑取拷貝數(shù)高的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用鼠抗c-myc單克隆抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢查酵母培養(yǎng)上清液中單鏈抗體A7蛋白的表達(dá)情況。并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡試驗(yàn)(WesternBlotting)確認(rèn)目的蛋白的分子量。結(jié)果：電泳檢查發(fā)現(xiàn)了大小分別為10000 bp和9300 bp左右的重組載體pPIC9K-ScFvA7基因和真核表達(dá)載體pPIC9K基因片段；經(jīng)PCR后電泳確定目的基因已整合到畢赤酵母染色體基因組中。經(jīng)檢測(cè)得知，誘導(dǎo)表達(dá)后的酵母培養(yǎng)液上清中有目的蛋白表達(dá)，而對(duì)照酵母培養(yǎng)液上清未發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。在SDS-PAGE和蛋白印跡試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一條分子量約為44KD的單一帶。結(jié)論：成功將重組載體pPIC9K-ScFvA7整合到畢赤酵母染色體基因組中，使ScFvA7蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)，并對(duì)此基因的表達(dá)情況進(jìn)行了初步鑒定，為下一步鑒定目的蛋白活性及特異性奠定了基礎(chǔ)，也為今后單鏈抗體對(duì)重癥肌無(wú)力的治療和基因治療準(zhǔn)備了材料。
[Abstract]:Objective: single chain variable scFvv gene was transformed into Pichia pastoris GS115 to screen positive transformants and induce protein expression to prepare single chain antibody protein. Methods: the target gene was extracted from Ecoli.DH5 偽 and purified. The correct pPIC9K recombinant vector was confirmed by electrophoretic analysis. The recombinant vector was linearized by restriction endonuclease Sal I, and electroporated into methanol-nutritious Pichia pastoris GS115. The genomic DNA of yeast was extracted to detect the insertion of exogenous gene. The positive transformants with high copy number were selected for methanol induced expression. The expression of scFv A7 protein in the supernatant of yeast culture was detected by dot blot hybridization with mouse anti c-myc monoclonal antibody. The molecular weight of the target protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Results: the recombinant vector pPIC9K-ScFvA7 gene and eukaryotic expression vector pPIC9K gene were found to be about 10000 BP and 9300 BP, respectively, and the target gene was integrated into the genome of Pichia pastoris by PCR electrophoresis. The results showed that the expression of target protein was found in the supernatant of yeast culture medium, but not in the supernatant of control yeast medium. A single band with a molecular weight of about 44KD was found in SDS-PAGE and Western blot. Conclusion: the recombinant vector pPIC9K-ScFvA7 was successfully integrated into the genome of Pichia pastoris and the ScFvA7 protein was successfully expressed in Pichia pastoris. It lays a foundation for the further identification of the activity and specificity of the target protein, and also provides materials for the treatment and gene therapy of myasthenia gravis by scFv in the future.
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1830861