本文選題：異種移植 + 人獸共患疾病　； 參考：《四川大學》2007年博士論文

【摘要】： 供器官嚴重不足是目前困擾移植界的重要難題之一。供器官短缺可從以下幾方面進行探索：(1)宣傳和發(fā)展自體移植，如自體骨髓／外周血細胞移植；(2)擴大同種異體供器官來源，如宣傳腦死亡立法，放寬對供者年齡的限制和倡導活體親屬供器官等；(3)人工器官／組織工程材料；(4)克隆技術／胚胎干細胞技術；(5)研究開發(fā)異種供器官源。 近年來，組織工程和胚胎干細胞的研究發(fā)展非常迅速并成為醫(yī)學界關注的焦點，但其臨床應用優(yōu)勢主要集中于創(chuàng)傷修復，而且相關研究仍處于早期階段，體內(nèi)外條件下能否誘導胚胎干細胞分化發(fā)育為實體器官尚無確切證據(jù)證實。因此，異種器官的開發(fā)和選擇仍是解決供器官短缺的重要途徑之一。以前曾一度認為靈長類動物因其親緣關系與人類最近，會成為最佳的異種器官供源，但由于靈長類動物屬瀕危物種，數(shù)目稀少，難以大量用于臨床移植，更重要的是靈長類動物體內(nèi)的病原體有使移植受者感染致病的危險，現(xiàn)已證實人免疫缺陷病毒(HIV)源自非洲綠猴，因此已將靈長類動物作為異種供器官源的可能性排除。 目前豬被公認為是最佳的異種供器官源。因豬的器官在形態(tài)學及解剖學上與人的器官相似，且在豬-人肝腎功能的匹配研究中也發(fā)現(xiàn)豬肝臟合成α、β球蛋白的能力與人相近，表明豬器官是具有人類器官相應生理功能的成熟器官。對豬-人異種組織的移植已經(jīng)進行了部分嘗試，如豬胰島細胞治療糖尿��；豬皮治療燒傷病人；豬神經(jīng)干細胞治療帕金森癥，及豬骨治療骨折病人等。 在豬-人移植的臨床研究中，雖然豬與人器官功能基本匹配，但仍有兩個主要障礙尚需攻克。一是排斥，因豬-人移植屬于遠緣移植，除同種異體移植常見的排斥反應外，還有超急性排斥，但隨著轉人CD55轉基因豬的出現(xiàn)及新型免疫抑制劑的開發(fā)和使用，，排斥反應得到了較好的控制；二是人獸共患病，即豬體內(nèi)的病原體可通過移植傳染給受者，進而傳播到健康人群，造成災難性后果。豬體內(nèi)存在著多種病原體，如布魯桿菌、鉤端螺旋體菌、皰疹病毒、馬腦炎病毒、球孢子菌、錐蟲菌、血吸蟲，以及近兩年引起人們高度重視的使人致病的豬鏈球菌，這些病原體都可能在移植后感染受者并致病，隨著現(xiàn)代動物飼養(yǎng)技術的提高，已可飼養(yǎng)出無病原體或無特定病原體(SPF)的豬，同時也可在移植前通過篩查去除豬器官中的病原體。但豬內(nèi)源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retroviruses，PERV)是整合在豬的基因組中，并能以孟德爾遺傳方式傳給后代的一種病毒，因此無法通過上述常規(guī)方式去除。 PERV為典型的哺乳動物C型逆轉錄病毒，具有gag，pol，env三個功能基因和3’，5’端長的末端重復序列結構(Long Terminal Repeat，LTR)。PERV以“前病毒”DNA的形式整合在其宿主——豬的細胞染色體中。PERV可分為γ(γ1～γ5)和β(β1～β4)兩類，定量PCR結果表明PERV的拷貝數(shù)從2個(β2和γ5)到約50個(γ1)。其中γ1、γ2和β4在成體豬的腎組織中處于活化狀態(tài)。野生型豬、舊世界豬(Suidae)和新世界豬(Tayassuidae)中僅發(fā)現(xiàn)一個逆轉錄亞群β2。γ1是已知具有感染力的亞群，其外殼蛋白基因(env)的SU區(qū)域的差異分為三種亞型，分別為PERV-A，PERV-B和PERV-C。PERV-A，-B可感染多種人源細胞及非人靈長類細胞，PERV-C僅感染特定豬來源的細胞。其他類型PERV還尚未證實有感染性。 PERV可在體外感染多種人源細胞系，如來源于T淋巴細胞、骨髓細胞、NK細胞及腎臟的細胞系。這種感染與細胞系的組織器官來源無關，而與這些細胞系的轉化方式及體外培養(yǎng)狀況相關。PERV在體外感染非人靈長類細胞的研究包括恒河猴肺部來源細胞(FRhL-2)、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(RF／6A)和腎臟來源細胞(BSC-1)，原代細胞包括恒河猴來源的肺、腎、主動脈和臍靜脈細胞。PERV可發(fā)生亞型間的重組，且感染力增強，增加了異種移植后發(fā)生種間感染的可能性。PERV還可作為誘導移植排斥的抗原，在豬到小鼠的皮膚移植模型中引發(fā)排斥反應。 PERV的體內(nèi)感染性研究因缺乏理想的模型導致結果不盡相同，動物實驗和臨床研究結果并不一致，因此目前對PERV的體內(nèi)感染性尚無確切結論，另外關于PERV致病性的相關研究尚無報道。臨床回顧性研究中，發(fā)現(xiàn)無論是在豬到非人靈長類的移植模型中，還是在用豬胰島治療糖尿病、豬皮膚治療燒傷病人、豬肝臟或腎臟搭橋進行體外灌注的研究中，均未找到PERV感染的證據(jù)。在動物模型的研究中，將豬的胰島移植到免疫缺陷小鼠中，3個月后檢測發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的多個組織均感染PERV。雖然在臨床檢測和動物模型研究中均未找到PERV體內(nèi)感染的證據(jù)，但是這些研究仍存在一系列問題：一是所研究的個體中只有少數(shù)接受了免疫抑制；二是病人與豬細胞的體內(nèi)接觸時間有限，在PERV還未建立感染時即被清除；三是在研究中僅檢測病人的外周血單個核細胞，未檢測病人體內(nèi)其他類型的細胞是否感染了PERV。目前尚不清楚PBMC表面是否存在PERV的感染受體，進一步研究仍是必要的。 在本課題組以前的研究中，曾對來自中國三個地方的豬種共117頭個體進行了PERV的流行病學調(diào)查，分離外周血白細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)在這些中國豬種中無PERV缺失個體，在基因組中的拷貝數(shù)較高，而且檢測到PERV的高表達。亞型分析中發(fā)現(xiàn)中國豬種的PERV以A，B亞型為主，且多數(shù)為A／B混合亞型，未發(fā)現(xiàn)C亞型的個體。對34頭版納微型豬近交系(BMI)的逆轉錄酶活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)RT活性在不同個體中有差異。目前國內(nèi)外尚無關于豬不同組織的PERV拷貝數(shù)和亞型是否存在差異的研究報道。本研究第一部分中，分離并提取BMI不同組織的DNA，用PCR及Real-Time PCR方法對同一豬個體中不同組織的PERV拷貝及亞型進行研究，以尋找低拷貝甚至缺失PERV的組織及器官；同時分離12頭BMI的外周血單個核細胞(PBMC)，用PHA及IL-2刺激72小時后進行致死性輻射，再與人源細胞系HEK293細胞共培養(yǎng)，以研究同一豬種不同個體對HEK293細胞的嗜性差異，并假設不同豬個體表達的PERV對同一種細胞會表現(xiàn)出不同的感染力及易感性。結果表明版納微型豬近交系中，17種組織及器官的基因組DNA中均有PERV-gag、pol的嵌合，所檢測的亞型均為A，B亞型，未檢測到-C亞型的個體，定量PCR結果發(fā)現(xiàn)pol基因的拷貝數(shù)在不同組織中的差異較大(甲狀腺：97.1；膀胱：1.4)，而gag、envA、envB在不同組織中的差異相對較小。應用細胞共培養(yǎng)的方法對12頭BMI中的PERV的嗜性差異進行分析，發(fā)現(xiàn)來自BMI的PBMC經(jīng)PHA及IL-2共刺激培養(yǎng)，并經(jīng)過致死性輻射后，與人源腎臟細胞系293共培養(yǎng)，有6頭BMI中的PERV可感染293細胞，另外6頭的PERV未感染，證實同一豬種不同個體所表達的PERV會對同一種細胞表現(xiàn)出不同的嗜性及感染力。 國外對PERV各功能基因的研究中，采用生物信息學軟件LOHA_(TM)研究PERV-A 14／220時發(fā)現(xiàn)其是由PERV-C與PERV-A序列重組而來，該克隆gag，pol，envTM均來自PERV-C，而env的受體結合區(qū)域(RBD)來自PERV-A，該850bp區(qū)域包括受體區(qū)域，因此改變了其細胞嗜性。另外，還發(fā)現(xiàn)來自PERV-C的多個決定域可明顯增加PERV-A 14／220的感染滴度。在PERV-NIH，PERV-C，PERV-A和PERV-B的長末端重復序列(LTR)的研究中表明PERV-A，-B相似性較大，而PERV-NIH和PERV-C的U3區(qū)域的差別較大。本課題組以前的研究中，曾研究了PERV體外長期感染HEK293細胞，檢測發(fā)現(xiàn)人源HEK293細胞長期感染PERV后在細胞形態(tài)、細胞倍增時間、細胞凋亡率、DNA含量、DNA合成能力等方面未發(fā)生明顯變化，但其細胞血清依賴性增強，提示在PERV長期感染人源細胞后未發(fā)現(xiàn)PERV導致的細胞病變。目前的研究尚未對中國豬種內(nèi)PERV的各功能基因進行深入研究，本研究第二部分用PCR及基因克隆測序，并結合生物信息學方法，對來自中國三個豬種(版納微型豬近交系、五指山豬、內(nèi)江豬)中的PERV各功能基因(gag、pol和env)以及長末端重復序列(LTR)與其他已報道的PERV序列及部分具致病性的逆轉錄病毒(C型、D型逆轉錄病毒及慢病毒)進行了序列對比及同源進化分析，對中國豬種中PERV的可能致病性及感染力進行評估。gag和pol基因的研究結果，發(fā)現(xiàn)來自中國三個豬種的PERV與部分具有致病性的C型，D型逆轉錄病毒及慢病毒(HIV-1)有共同的同源結構域，并可找到兩個高度匹配的結構域；env基因的研究也同樣發(fā)現(xiàn)了與gag、pol一樣的同源區(qū)域，該區(qū)域位于env基因的受體結構域，表明PERV與其他C型逆轉錄病毒在受體結合方面有一定的共同性；對這三個功能基因所構建的同源進化樹研究中，發(fā)現(xiàn)中國豬種中的PERV與部分C型逆轉錄病毒有共同的同源進化關系；LTR研究發(fā)現(xiàn)BMI及WZSP中的LTR與PERV-A，-B有較高的同源性，但在序列的重復次數(shù)中存在差異，提示其感染力的差異，而NJP中的PERV-LTR與PERV-C的同源性較高。 抗病毒的常規(guī)途徑有兩種：疫苗及藥物。國外研究用11種已在FDA注冊的用于HIV治療的化學藥物，其中包括6種抗核苷酶藥物和5種蛋白酶抑制劑，在體外實驗中研究這些藥物對PERV的抗病毒作用，結果發(fā)現(xiàn)11種抗HIV藥物中，僅齊多夫定有潛在的臨床應用價值。另外的研究采用最新RNA干擾技術，對PERV在靶細胞中的表達進行抑制，表明該技術可用于以后的抗病毒治療。本研究第三部分在此基礎上，根據(jù)生物信息學所研究的同源區(qū)域，設計針對PERV功能基因gag、pol及LTR的小片段干擾RNA(siRNA)，用脂質(zhì)體轉染的方法導入高表達PERV的PK15細胞中，檢測不同的siRNA對PERV表達抑制的效果，以尋找新的抗病毒位點。結果發(fā)現(xiàn)來自LTR的siRNA未起到抑制表達的作用，而來自gag、pol的G1，G2，P1，P2中，P2的表達抑制作用最強，G1只能起到微弱的抗感染作用，且抑制作用在轉染后48小時最強，并且具有劑量依賴性。 以上結果表明，在所檢測的BMI各組織器官的基因組中均存在PERV各功能基因，對其拷貝數(shù)的研究證實各組織器官也無實質(zhì)性差異，表明并無PERV缺失的組織或器官，提示在臨床應用中，尋找無PERV的組織器官優(yōu)先用于臨床治療是不現(xiàn)實的；生物信息學研究發(fā)現(xiàn)來自三個中國豬種的PERV的三個功能基因gag、pol、env與部分具有致病性的C型，D型逆轉錄病毒及慢病毒(HIV-1)存在一定的同源性，gag和pol的同源序列分別屬于種群特異抗原和編碼逆轉錄酶區(qū)域，表明PERV與C型逆轉錄病毒具有相似的種群抗原特異性，且PERV也可編碼與這些病毒相似的逆轉錄酶；env序列研究中，PERV與其他逆轉錄病毒的同源序列位于受體結合區(qū)域，提示PERV與這些病毒在感染宿主細胞方面有很大的相似性；這些結果均表明即使尚未找到PERV致病的證據(jù)，但由于PERV的各功能基因與這些致病病毒的相似性，仍不能忽略PERV的潛在致病性，及PERV與其他病毒發(fā)生重組并發(fā)生變異的危險性。LTR研究發(fā)現(xiàn)同一豬種(BMI)的序列重復次數(shù)存在差異，說明同一豬種內(nèi)的PERV存在感染力的強弱及嗜性的差異，該結果有助于在以后的臨床研究應用中，選擇體內(nèi)PERV感染力較弱的個體用于臨床治療。RNA干擾實驗證實了siRNA可在靶細胞中有效抑制PERV的表達，表明RNA干擾可用于PERV的表達控制，RNA干擾不僅可克服抗病毒藥物所帶來的副作用問題，最大的優(yōu)點是可以靶向降低PERV的表達，而不會對宿主細胞內(nèi)其他基因的正常表達產(chǎn)生影響。 綜上所述，本實驗結果及本課題組以前的工作表明PERV雖可在體外感染多種人源細胞，但未發(fā)現(xiàn)PERV可引起其宿主細胞病變；國外的臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)在用豬組織、細胞進行臨床治療，或用豬肝臟、腎臟的搭橋治療中，均未找到PERV在體內(nèi)感染的證據(jù)。但PERV的潛在致病性仍不能忽視，因病毒經(jīng)常發(fā)生重組并改變原病毒的感染力及宿主范圍，以后的工作應致力于研究PERV的重組特性，并進一步提高現(xiàn)有PERV感染性、致病性檢測方法的敏感性及特異性，以達到控制并最終排除PERV所引起的跨種感染。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R617

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王燕群;徐志文;郭萬柱;朱玲;梅淼;;豬巨細胞病毒SC株DNA聚合酶基因的克隆及生物信息學分析[J];中國獸醫(yī)科學;2011年09期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關會議論文 前10條

1 ;異種移植臨床試驗管理要求[A];生命倫理學通訊（2009年第1期）[C];2009年

2 黃正根;吳軍;羅高興;賀偉峰;譚江琳;王曉娟;胡婕;楊世偉;彭旭;楊俊杰;彭彥孟;甘成軍;陳希煒;程文廣;袁順宗;張小容;葛良鵬;魏泓;;胎豬皮膚前體組織異種移植后的生長發(fā)育鑒定[A];第八屆西南五省一市燒傷整形學術會議暨貴州省醫(yī)學會燒傷整形分會2010年學術年會論文匯編[C];2010年

3 蔡玉芳;王燕蓉;沈新生;崔岫;;胎兒卵巢組織異種移植后的組織學研究[A];中國解剖學會第十一屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文匯編[C];2009年

4 張治;沈振亞;;胸腺修飾和全身照射預處理受體在豬-猴異種移植模型中對獼猴抗豬抗體產(chǎn)生的影響[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

5 吳健敏;黃紅梅;章金剛;;豬內(nèi)源性反轉錄病毒與異種移植安全性的研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會成立大會暨第一次學術研討會論文集[C];2008年

6 邢曉為;易受南;董瓊;葉斌;童瓊娟;葉征;王維;;異種移植候選供體寧鄉(xiāng)豬內(nèi)源性逆轉錄病毒調(diào)查[A];第八次全國醫(yī)學遺傳學學術會議(中華醫(yī)學會2009年醫(yī)學遺傳學年會)論文摘要匯編[C];2009年

7 宋繼昌;李濤;舒桂明;杜智;孫綿方;;APA微囊豬肝細胞異種移植研究[A];21世紀醫(yī)學工程學術研討會論文摘要匯編[C];2001年

8 王海燕;聶剛;李濤;郭守利;王海霞;林彥;;異種動物移植中超急排斥反應動物模型的建立[A];中國實驗動物學會第五屆學術年會論文匯編[C];2000年

9 李志洪;黃信孚;李吉友;柯?lián)P;陽蘭桂;王永信;姚麗華;呂允威;王培林;;人乳腺癌異種移植及自發(fā)性轉移的研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

10 李志洪;黃信孚;李吉友;柯?lián)P;陽蘭桂;王永信;姚麗華;呂允威;王培林;;人乳腺癌裸鼠異種移植及自發(fā)性轉移的研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

相關重要報紙文章 前10條

1 記者 龍軍　特約記者 禹愛華;《長沙宣言》將推動國際異種移植發(fā)展[N];光明日報;2008年

2 記者 段涵敏;首個異種移植國際標準將在長產(chǎn)生[N];湖南日報;2008年

3 暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心 王通博士;異種移植 曲徑通幽[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

4 記者 王君平;全球異種移植臨床研究者共商“規(guī)范”[N];人民日報;2008年

5 徐蘭山　徐石平;猛士高歌借大風[N];科技日報;2008年

6 本報記者　 楊熙明 譚克揚;異種胰島細胞移植[N];湖南日報;2006年

7 金晶;動物器官移植給人,德研究有新進展[N];新華每日電訊;2006年

8 董家鴻;免疫耐受:夢寐以求“上上之策”[N];健康報;2003年

9 本報記者 顏秋雨　康平 通訊員 李虹輝;王維 心中有夢就能飛[N];健康報;2009年

10 項錚;器官移植：實現(xiàn)人類久遠的夢想[N];科技日報;2001年

相關博士學位論文 前10條

1 張立;豬內(nèi)源性逆轉錄病毒分子特性的研究及抗病毒位點的選擇[D];四川大學;2007年

2 楊光倫;NF-κB信號傳導途徑在延遲性異種移植排斥反應中的作用[D];重慶醫(yī)科大學;2003年

3 張明軍;小鼠STO細胞植入無免疫抑制成年大鼠肝臟的異種移植研究[D];第一軍醫(yī)大學;2004年

4 劉浩;類纖維蛋白原蛋白在異種移植中的作用[D];中國醫(yī)科大學;2002年

5 關兆杰;抗凝治療對延遲性異種移植排斥反應的作用[D];汕頭大學;2003年

6 李志偉;人肝門部膽管癌裸鼠肝門移植模型的建立及CD、HSV-tk雙自殺基因治療實驗研究[D];山東大學;2004年

7 孟強;天然抗體、補體及c-myc基因在異種移植超急性排斥反應中的作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1999年

8 吳群;豬—人異種移植相關實驗研究——中國豬種SLA基因序列分析及人NK細胞通過胞吐途徑殺傷豬內(nèi)皮細胞的機制探討[D];武漢大學;2004年

9 宋寧;在異種移植中血紅素氧化酶-1對內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制的研究[D];復旦大學;2005年

10 雷瑞鵬;異種移植：哲學反思與倫理問題[D];華中科技大學;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 周格知;裸小鼠異種移植人腦膠質(zhì)瘤中血管形成相關因子的初步研究[D];蘇州大學;2003年

2 晏青燕;與異種器官移植相關的寡糖抗原及其類似物的一釜合成研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2003年

3 張友來;凍干輻照豬硬腦膜異種移植的實驗研究[D];南昌大學;2009年

4 萬斌;NO對微囊化兔神經(jīng)組織移植后大鼠脊髓損傷的作用[D];江西醫(yī)學院;2005年

5 韓愛卿;人胎兒卵巢異種移植的組織學研究[D];山東大學;2005年

6 葛良鵬;大鼠糖尿病潰瘍模型的制備及其生物學特性的初步研究[D];西南師范大學;2005年

7 朱耀生;臨床醫(yī)學研究中帶有缺失數(shù)據(jù)和截斷數(shù)據(jù)的統(tǒng)計推斷方法[D];東北師范大學;2006年

8 戴江華;微囊化異種神經(jīng)組織細胞移植對脊髓損傷后細胞凋亡及相關基因表達的影響[D];江西醫(yī)學院;2004年

9 鄒春芳;人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及～（131）I標記單抗OC125的實驗研究[D];江西醫(yī)學院;2004年

10 郝念;角膜體外重建異種生物載體材料生物相容性研究[D];暨南大學;2004年

本文編號：1813171