本文選題：酒精 + 軸裂��； 參考：《山東大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 關(guān)于酒精對人類胎兒的發(fā)育毒性最初報道于1968年，孕婦飲酒會導(dǎo)致胎兒酒精綜合癥(FAS)。FAS的主要特征是發(fā)育延遲、心臟異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、顱面部特征異常及骨骼缺陷等。據(jù)估計，在一般人群中，新生兒的FAS發(fā)生率為1.2‰。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是酒精的作用靶標(biāo)，酒精處理會導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷(neural tube defeots，NTDs)，而NTDs是最普遍的先天性缺陷之一，發(fā)生率為0.5-12‰，但對其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。斑馬魚屬硬骨魚，是發(fā)育生物學(xué)的模式生物之一，已被證明為人類疾病和藥物毒性評價的理想動物模型。本研究以斑馬魚為模式動物，研究酒精對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響，試圖揭示酒精對胚胎發(fā)育的影響機(jī)制，以期為人類先天性神經(jīng)管缺陷的防治提供理論依據(jù)，為孕婦杜絕飲酒和優(yōu)生優(yōu)育提供科學(xué)指導(dǎo)。 本研究首先用不同濃度的酒精處理不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎，通過系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，酒精對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響存在明顯的時期和濃度依賴性，3％酒精于dome期開始處理胚胎3h對胚胎的體軸發(fā)育影響明顯，極易引起軸裂(split axis)，即體軸后部出現(xiàn)分叉，但在近尾部區(qū)又合在一起。綜合形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察及原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軸裂胚胎的體軸后部出現(xiàn)了2條脊索、神經(jīng)管及2套體節(jié)，與人類的神經(jīng)管缺陷脊柱裂的表型有相似性。通過分析推斷，軸裂胚胎2條神經(jīng)管和2套體節(jié)的形成可能是由裂開的脊索誘導(dǎo)的。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，酒精處理可明顯地延遲胚胎的發(fā)育，從dome期開始處理3h后，酒精處理胚胎僅處于50％下包期，而正常胚胎發(fā)育至接近70％下包，受精后大約11h酒精處理胚胎仍處于原腸胚期，而胚胎細(xì)胞的集中延伸運(yùn)動是該時期的關(guān)鍵事件。為了進(jìn)一步探尋酒精引起軸裂的致畸機(jī)制，利用原位雜交方法研究了酒精處理胚胎中幾個發(fā)育相關(guān)重要基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒精處理對體軸發(fā)育相關(guān)基因ntl，MyoD，neurogeninl，tbx6和gsc的表達(dá)圖式具有明顯的影響，特別于受精后大約11h，酒精處理胚胎與正常胚胎上述5個基因的表達(dá)圖式差異顯著，ntl的表達(dá)區(qū)域在酒精處理胚胎的背部分為兩部分，MyoD的表達(dá)區(qū)域變寬，neurogeninl在腹側(cè)原神經(jīng)細(xì)胞叢中的表達(dá)出現(xiàn)分叉，tbx6的表達(dá)區(qū)域明顯變大，且在預(yù)定體節(jié)板中的表達(dá)圖式不規(guī)則，gsc的表達(dá)區(qū)域分為兩部分，這些結(jié)果提示，酒精干擾神經(jīng)外胚層和中胚層細(xì)胞的集中延伸運(yùn)動，特別是ntl表達(dá)細(xì)胞不能集中到體軸中線處。而ntl已證明與斑馬魚胚胎的集中延伸運(yùn)動存在密切關(guān)系，是脊索區(qū)集中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，與非經(jīng)典的Wnt信號通路共同調(diào)節(jié)斑馬魚身體后部的形態(tài)發(fā)生。因此可以推斷，酒精干擾胚胎細(xì)胞的集中延伸運(yùn)動引起軸裂。 文昌魚是一種頭索動物，被認(rèn)為是現(xiàn)存的最接近于脊椎動物的無脊椎動物，具有許多脊椎動物發(fā)育相關(guān)基因的同源基因，是研究動物發(fā)育機(jī)制及脊椎動物起源與進(jìn)化的典型材料。斑馬魚是研究脊椎動物發(fā)育機(jī)制的理想動物模型。隨著分子水平研究的不斷深入，對文昌魚和斑馬魚發(fā)育機(jī)制的研究取得了較大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些重要的發(fā)育相關(guān)基因。但是，動物胚胎發(fā)育受動態(tài)的、網(wǎng)絡(luò)化的基因調(diào)控，還需要做大量的深入、系統(tǒng)的研究。本研究首次克隆了文昌魚發(fā)育相關(guān)基因AmphiMef2、Amphi-mMRLC和hadh2的全長cDNA，并對其進(jìn)行了演繹蛋白特性分析、進(jìn)化生物學(xué)分析及發(fā)育表達(dá)研究。為了進(jìn)一步揭示在進(jìn)化過程中基因功能的變化，我們又克隆了斑馬魚的Z-MRLC和hadh2基因，并與文昌魚的同源基因進(jìn)行了比較研究。本研究為揭示文昌魚、斑馬魚的發(fā)育機(jī)制及闡明在生物進(jìn)化過程中基因功能的變化提供了重要資料。 通過對青島文昌魚的cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序，發(fā)現(xiàn)了一個與其它物種的肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(Mef2)基因的3′端序列具有較高同源性的EST片段，通過設(shè)計兼并引物進(jìn)行RT-PCR，獲得了全長cDNA。演繹蛋白的的氨基酸序列分析結(jié)果表明，演繹蛋白具有高度保守的MADS和MEF結(jié)構(gòu)域，與MADS家族的其它MEF2成員類似，這兩個區(qū)域與其它物種的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸一致性在90％以上，因此，將該cDNA定名為AmphiMef2。進(jìn)化生物學(xué)分析表明，該蛋白更接近于脊椎動物的同源蛋白，位于脊椎動物分支的基部。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2屬轉(zhuǎn)錄因子MADS家族成員，它能控制脊椎動物肌肉特異基因的表達(dá)，但在無脊椎動物中，并非所有的Mef2基因都是肌肉發(fā)育所必需的。原位雜交結(jié)果顯示，AmphiMef2具有明顯的時空表達(dá)特異性，首先在早神經(jīng)胚(大約受精后10h)的預(yù)定體節(jié)中胚層中表達(dá)，之后在體節(jié)和未分割的預(yù)定體節(jié)中胚層中表達(dá)。但從幼蟲早期(24h)開始，前部體節(jié)中的表達(dá)水平開始下調(diào)。36h幼蟲期，，只在后部體節(jié)中檢測到它的表達(dá)。至48h幼蟲期，AmphiMef2在整個體節(jié)中的表達(dá)消失，其表達(dá)區(qū)域轉(zhuǎn)移至口前窩(一個與脊椎動物腺垂體同源的器官)，且持續(xù)表達(dá)至72h幼蟲期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，文昌魚AmphiMef2可能不但參與肌肉發(fā)生，而且可能在口前窩的發(fā)育或功能發(fā)揮中起作用。AmphiMef2是否在文昌魚生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中起作用值得進(jìn)一步研究證實(shí)。 通過對青島文昌魚神經(jīng)胚cDNA文庫進(jìn)行規(guī)�；瘻y序，并借助于RT-PCR，獲得了含有504 bp完整開放閱讀框的Amphi-mMRLC cDNA序列，該序列編碼167個氨基酸。根據(jù)GenBank的序列設(shè)計引物，利用RT-PCR獲得含有519 bp完整開放閱讀框的斑馬魚Z-MRLC(Similiar to 19.9 KD myosin light chain isoform 1)cDNA序列，該序列編碼172個氨基酸。對這兩個cDNA序列演繹蛋白的蛋白質(zhì)特性分析比較發(fā)現(xiàn)，Amphi-mMRLC與Z-MRLC蛋白具有一定的相似性，均具有EF-hand結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)接近，二級結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲比例接近，但是這兩個蛋白之間也存在明顯的差異，如序列長度、氨基酸組成、磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量等。序列比對結(jié)果表明，Amphi-mMRLC和Z-MRLC演繹蛋白的氨基酸一致性為46％，與爪蟾、牛、雞、人、褐家鼠及海綿同源蛋白的氨基酸一致性達(dá)46％-47％。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹中，文昌魚Amphi-mMRLC和斑馬魚Z-MRLC序列分別位于無脊椎動物和脊椎動物分支上，基本符合生物進(jìn)化規(guī)律。整封原位雜交結(jié)果表明，文昌魚和斑馬魚的MRLC基因的表達(dá)圖式存在明顯差異。Amphi-mMRLC首先在文昌魚早神經(jīng)胚期的預(yù)定體節(jié)中胚層中表達(dá)，隨后限定在體節(jié)及肌刀中表達(dá)，并且這種表達(dá)模式持續(xù)至72h幼蟲期。在文昌魚整個發(fā)育過程中，在非肌刀肌肉組織中未檢測到Amphi-mMRLC的表達(dá)。但是，在斑馬魚的體節(jié)中并未檢測到Z-MRLC的表達(dá)。Z-MRLC于體節(jié)期在心臟原基、頭部中胚層中的表達(dá)較強(qiáng)，在分化中的內(nèi)胚層中表達(dá)較弱。受精后72h，它的表達(dá)限定在心臟、背部主動脈、腸道上皮和耳泡中。由于文昌魚Amphi-mMRLC與其它無脊椎動物的同源基因均在肌肉組織中表達(dá)，因此推斷，無脊椎動物的MRLC可能參與肌肉發(fā)生。而脊椎動物的MRLC家族具有更多的成員及更廣泛的功能。由此可見，MRLC家族成員在進(jìn)化過程中發(fā)生了變化，出現(xiàn)了新的成員和新的功能。 羥�；o酶A脫氫酶Ⅱ(hadh2)是一種多功能線粒酶，它具有多種生理功能，并與人類一些疾病特別是先天性出生缺陷存在密切關(guān)系。hadh2基因突變會造成MHBD(2-甲基-3羥基丁酰CoA脫氫酶)不足，而MHBD不足會引起一種異亮氨酸代謝先天性出生缺陷。通過對青島文昌魚cDNA文庫進(jìn)行規(guī)�；瘻y序及借助于RT-PCR，我們首次獲得了文昌魚hadh2基因的全長cDNA。為了進(jìn)一步研究hadh2在文昌魚和斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用及其在進(jìn)化過程中的功能變化，我們根據(jù)GenBank中的斑馬魚hadh2序列設(shè)計特異引物進(jìn)行RT-PCR，獲得了斑馬魚hadh2片段。通過對文昌魚和斑馬魚hadh2演繹蛋白的蛋白質(zhì)特性分析比較發(fā)現(xiàn)，二者演繹蛋白的氨基酸序列長度相同，均為260個氨基酸，氨基酸組成略有差異，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量幾乎相等，均含有保守的結(jié)構(gòu)域，即短鏈酒精脫氫酶(adh-short)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化生物學(xué)分析表明，文昌魚hadh2與斑馬魚hadh2的氨基酸一致性達(dá)70％，文昌魚的hadh2位于系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹脊椎動物分支的基部，與脊椎動物的同源蛋白具有較近的親緣關(guān)系。胚胎整封原位雜交結(jié)果表明，文昌魚hadh2首先于神經(jīng)胚中期(受精后大約12h)分化中的內(nèi)胚層和中胚層中表達(dá)，之后在內(nèi)胚層、臟壁中胚層及后部神經(jīng)管中表達(dá)，至30 h幼蟲期，其表達(dá)限定在腸道上皮和臟壁中胚層中，在神經(jīng)管中的表達(dá)消失，至72h幼蟲期，它的表達(dá)限定在腸道上皮中。與文昌魚hadh2相比，斑馬魚的hadh2是一種母源性表達(dá)的基因，在原腸胚期表達(dá)下調(diào)，至晚體節(jié)期，hadh2在頭部中胚層、內(nèi)胚層及眼睛中的表達(dá)較強(qiáng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)較弱，但在后部神經(jīng)管中未檢測到hadh2的表達(dá)。由此可見，hadh2可能在文昌魚和斑馬魚胚胎發(fā)育過程中起重要作用，但是在進(jìn)化過程中某些功能發(fā)生了變化。
[Abstract]:This paper studies the effect of alcohol on early embryonic development of zebrafish , which is one of the most common congenital defects . It is an ideal animal model to study the effect of alcohol on the development of embryonic development of zebrafish .









In order to find out the effect of alcohol treatment on the development of embryonic development , the expression of genes ntl , MyoD , neurogeninl , tbx6 and gsc in human embryonic stem cells was significantly affected by alcohol treatment .









AmphiMef2 , Amphi - mMRLC and hadh2 gene were cloned from AmphiMef2 , Amphi - mMRLC and hadh2 in order to further reveal the development mechanism of amphioxus and zebrafish .









The cDNA library of amphioxus ( AmphiMef2 ) has a high homology with other MEF2 members of other species . The results suggest that AmphiMef2 has a highly conserved MADS and MEFs domain , and it can control the expression of muscle specific gene in vertebrate .









In this paper , the expression of Amphi - mMRLC and Z - MRLC protein was found to be 46 % . The results showed that Amphi - mMRLC and Z - MRLC were similar to those of human , brown and sponge . The results showed that the expression of Amphi - mMRLC and Z - MRLC was 46 % .









In order to further study the role of hadh2 in the embryonic development of amphioxus and zebrafish hadh2 , the expression of hadh2 gene of amphioxus in the embryonic development of amphioxus and zebrafish is nearly equal to 70 % . The expression of hadh2 in the central nervous system is weak , but the expression of hadh2 in the central nervous system is weak .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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1 郭新軍;擬黑多刺蟻肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2與肌鈣蛋白Ⅰ亞基基因的克隆及其在發(fā)育中的表達(dá)研究[D];陜西師范大學(xué);2010年

本文編號：1785572