發(fā)布時間：2018-04-18 17:23

  本文選題：3T3-L1前脂肪細胞 + 脂肪分化��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2007年博士論文

【摘要】： 一、3T3-L1前脂肪細胞的培養(yǎng)、鑒定及標志物檢測 背景和目的: 3T3-L1前脂肪細胞株,目前最常用的前脂肪細胞株之一,是一種從Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分離克隆獲得的具有脂肪細胞分化潛力的細胞株,在融合成單層的情況下具有自發(fā)分化為成熟脂肪細胞的能力。該細胞株不但在體外經(jīng)誘導后可分化為成熟的脂肪細胞,而且植入小鼠體內(nèi)后也可分化并形成與正常脂肪組織無明顯差別的脂肪團塊。3T3-L1前脂肪細胞在形態(tài)學上類似于成纖維細胞,在經(jīng)歷了生長停滯和克隆性擴增后,在經(jīng)典的激素雞尾酒,即胰島素(insulin, INS)、地塞米松(dexamethasone, DEX)和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, MIX)的刺激下,前脂肪細胞逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐?細胞骨架以及細胞外基質(zhì)成分和水平發(fā)生變化,脂質(zhì)積聚,最終分化為成熟的脂肪細胞。由于3T3-L1前脂肪細胞可較好模擬脂肪細胞分化和活體脂肪組織的功能,因此目前已成為肥胖及體外脂肪細胞分化研究的一個常用工具。而如何在體外培養(yǎng)中,采用合適的培養(yǎng)條件、合理的培基配制及誘導劑的使用濃度對于脂肪細胞活力、生存狀態(tài)及其分泌能力都有重要的影響。本部分實驗通過對3T3-L1前脂肪細胞的形態(tài)、生長增殖、脂肪含量等細胞生物學特性的研究,誘導分化3T3-L1前脂肪細胞,摸索培養(yǎng)和誘導3T3-L1前脂肪細胞的最佳條件,為應用藥物干預3T3-L1前脂肪細胞增殖分化以及后期研究3T3-L1前脂肪細胞分化過程中基因表達等奠定基礎。 方法: 1、3T3-L1前脂肪細胞的復蘇、體外培養(yǎng)、計數(shù)以及細胞凍存; 2、3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化; 3、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細胞; 4、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化過程中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisomal proliferation activated receptor-gamma , PPARγ2)基因表達變化。 結(jié)果: 1、采用含10%FBS、4mmol/l L-谷氨胺酰和100u/ml青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基成功進行了3T3-L1前體脂肪細胞的體外復蘇、培養(yǎng)和傳代; 2、在體外培養(yǎng)的基礎上,采用傳統(tǒng)的雞尾酒誘導劑(0.5 mmol/L MIX、0.25 umol/ L DEX和10ug/ ml INS)成功地完成了3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化。 3、油紅O染色顯示3T3-L1前脂肪細胞分化成熟過程中的脂滴形成情況,并證實3T3-L1脂肪細胞誘導分化成功。 4、PPARγ2 mRNA水平在3T3-L1前脂肪細胞(加入誘導劑開始誘導分化,D0)中表達極低,隨著誘導分化逐步成熟,其表達量逐步增加,至誘導分化D9~D10其表達量最高,提示脂肪細胞分化完全成熟。 結(jié)論: 本部分實驗通過對3T3-L1前脂肪細胞的形態(tài)、生長增殖、脂肪含量等細胞生物學特性的研究,摸索出了培養(yǎng)和誘導3T3-L1前脂肪細胞的最佳培養(yǎng)條件和誘導劑濃度,油紅O染色以及脂肪細胞中PPARγ2基因表達的檢測均顯示3T3-L1脂肪細胞誘導分化成熟,為應用藥物干預3T3-L1前脂肪細胞增殖分化以及后期研究3T3-L1前脂肪細胞分化過程中基因表達等奠定基礎。 二、3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化中PTP1B表達變化 背景和目的: 作為最早被純化的蛋白酪氨酸磷酸酶之一,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)一直被認為是胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導的主要負性調(diào)控因子,近年來更是成為治療肥胖、2型糖尿病等胰島素抵抗相關疾病的新靶點。 多項研究證實,無論是基因敲除PTP1B還是PTP1B反義核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)處理均可使實驗小鼠肝臟和肌肉組織中胰島素受體后胰島素受體(insulin receptor, InsR)和胰島素受體底物蛋白(insulin receptor substrate protein, IRS)的磷酸化增強,胰島素信號傳導增強,提高胰島素敏感性。然而,在同樣是胰島素主要作用靶點的脂肪組織的研究中,關于PTP1B對脂肪組織胰島素敏感性的影響則完全不同。在PTP1B基因敲除小鼠中,與肝臟及肌肉中胰島素受體磷酸化增強、胰島素敏感性提高相對應的是,脂肪組織中胰島素受體的去磷酸化絲毫未受影響,無論是胰島素受體磷酸化的最大水平還是達到該最大水平所需時間都無變化。另外,以PTP1B ASO處理ob/ob小鼠可見到小鼠體重減低,參與脂肪合成的多種基因如固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein, SREBP-1)表達減少,成脂作用減弱;而與胰島素相關的蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)磷酸化無改變,脂肪細胞中胰島素介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運無影響。而一項最新的研究又提示在脂肪組織中特異性敲除PTP1B基因可見到小鼠的體重增加。那么,PTP1B在脂肪細胞分化成熟中的作用到底是什么呢?我們首次采用3T3-L1前脂肪細胞系,通過體外培養(yǎng)誘導分化,觀察脂肪細胞分化成熟過程中PTP1B表達變化,為進一步揭示PTP1B在脂肪細胞分化和脂質(zhì)積聚過程中的作用提供線索。 方法: 1、3T3-L1細胞的培養(yǎng)和誘導分化; 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細胞; 3、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(shù)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測3T3-L1前脂肪細胞分化過程中PTP1B mRNA表達; 4、采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-FQ PCR )半定量檢測3T3-L1前脂肪細胞分化過程中PTP1B mRNA表達; 5、采用western blot方法檢測3T3-L1前脂肪細胞分化過程中PTP1B蛋白水平表達。 結(jié)果: 1、在本實驗中,我們成功培養(yǎng)了3T3-L1前體脂肪細胞并誘導其分化成熟。 2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測3T3-L1前脂肪細胞誘導分化過程中PTP1B基因表達顯示,PTP1B mRNA表達在前脂肪細胞中(加入誘導劑,D0)最豐富,隨著誘導分化的逐漸成熟,其表達也逐步減低,至誘導第10天(D10)脂肪細胞完全成熟時降至最低點。其中D1~3、D4~8、D9~10各階段內(nèi)表達未見明顯差異,三組階段之間可見PTP1B mRNA表達差異顯著。 3、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-FQ PCR)半定量檢測3T3-L1前脂肪細胞誘導分化過程中第1~10天的PTP1B基因表達顯示,PTP1B mRNA表達在前脂肪細胞中最豐富,隨著誘導分化的逐漸成熟,其表達也逐步減低,至D10脂肪細胞完全成熟時降至最低點。 4、3T3-L1前脂肪細胞誘導分化過程中,PTP1B蛋白表達情況與其mRNA表達相平行,在前脂肪細胞中最豐富,隨著誘導分化的逐漸成熟,蛋白水平逐步減低,至D9蛋白表達顯著減少,D10脂肪細胞完全成熟時表達最少。其中D1~3、D4~8各階段內(nèi)表達未見明顯差異,但D1~3、D4~8、D9和D10之間可見PTP1B蛋白表達差異顯著。 結(jié)論: 本研究首次發(fā)現(xiàn)在3T3-L1前脂肪細胞分化成熟過程中,PTP1B mRNA及蛋白表達水平隨著脂肪細胞分化成熟而逐步減低,至脂肪細胞完全成熟時達到最低點,提示PTP1B對于脂肪組織分化成熟的直接作用是抑制性的,PTP1B水平降低對于脂肪細胞分化成熟,脂質(zhì)積聚則起到了“允許”甚至是“促進”作用。 三、腫瘤壞死因子-α及羅格列酮對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化過程中PTP1B表達的影響 背景和目的: 已經(jīng)證實,除了調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡外,脂肪組織,作為一個重要的內(nèi)分泌器官,分泌多種激素和細胞因子如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子等,參與了機體更廣泛、更復雜、更重要的內(nèi)分泌代謝調(diào)控。越來越多的研究表明,脂肪細胞分化異常,而并非僅僅的脂肪組織過度生成,才是發(fā)生2型糖尿病、高血壓、冠心病等代謝性疾病的罪魁禍首。與糖尿病、冠心病等密切相關的中央型肥胖很可能是由于脂肪組織分化異常,無法產(chǎn)生足夠數(shù)量的正常成熟脂肪細胞存儲過多的能量,進而將生脂壓力轉(zhuǎn)嫁至肝臟、肌肉等器官,導致脂肪異位沉積,最終誘發(fā)一系列的代謝性疾患。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B,由于其可使胰島素受體(InsR)及胰島素受體底物蛋白(IRSs)等的酪氨酸脫磷酸化,一直被認為是胰島素信號傳導的負性調(diào)控因子。然而,PTP1B在機體各組織中的作用存在著明顯的組織特異性。在肌肉、肝臟組織中已證實PTP1B水平降低,可使胰島素受體和胰島素受體底物蛋白磷酸化明顯增強,反映胰島素敏感性的指標如胰島素誘導的機體葡萄糖處置力(insulin stimulated whole-body glucose disposal, ISGD)顯著提升。而對于脂肪組織而言,PTP1B的作用目前仍不清楚,這些作用與機體胰島素敏感性之間的關系,更是不得而知。 為此我們采用體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞,觀察脂肪細胞誘導分化過程中PTP1B蛋白表達水平變化,再以羅格列酮和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)分別干預脂肪細胞分化成熟過程并觀察PTP1B蛋白表達情況,以期了解PTP1B在脂質(zhì)合成和成脂過程的作用以及羅格列酮及腫瘤壞死因子-α分別影響脂肪細胞胰島素敏感性的機制。 方法: 1、3T3-L1細胞的培養(yǎng)和誘導分化; 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細胞; 3、采用western blot方法檢測不同誘導劑誘導分化三組3T3-L1前脂肪細胞分化過程中PTP1B蛋白水平表達。 4、采用免疫沉淀和western blot方法檢測三組3T3-L1前脂肪細胞分化成熟時胰島素受體表達及胰島素受體酪氨酸磷酸化水平。 結(jié)果: 1、在本實驗中,我們成功建立了腫瘤壞死因子-α和羅格列酮干預3T3-L1前脂肪細胞誘導分化的適當工作濃度和條件。 2、三組3T3-L1前脂肪細胞分化過程中,與正常誘導組相比,羅格列酮干預組脂肪細胞分化得到促進,腫瘤壞死因子-α干預組則脂肪分化成熟受到抑制。 3、三組3T3-L1脂肪細胞分化成熟過程中,PTP1B蛋白表達趨勢均表現(xiàn)為在前脂肪細胞中最為豐富,并隨誘導分化成熟其表達逐步減少,至分化完全成熟時降至最低。但各組中PTP1B顯著降低的拐點有所不同,正常誘導組與腫瘤壞死因子-α干預組在加入誘導劑誘導分化第9天(D9)出現(xiàn),羅格列酮干預組則出現(xiàn)在第8天(D8)。 4、比較三組脂肪細胞在誘導分化后期第7至第10天(D7~D10)PTP1B蛋白水平變化,進一步證實正常誘導組與腫瘤壞死因子-α干預組均在誘導分化第9天(D9)出現(xiàn)PTP1B蛋白表達水平顯著降低,而羅格列酮干預組在第8天(D8)即出現(xiàn)PTP1B蛋白表達水平顯著降低;PTP1B蛋白水平在腫瘤壞死因子-α干預組誘導分化第7天(D7)較同期正常誘導組顯著增加,羅格列酮干預組的第8天(D8)及第10天(D10)則較正常誘導組同期顯著減少,羅格列酮干預組的誘導分化后期第7至第10天(D7~D10)中PTP1B蛋白表達水平更是明顯低于腫瘤壞死因子-α干預組誘導分化的同期水平。 5、三組3T3-L1脂肪細胞分化成熟時胰島素受體蛋白水平無差異,而胰島素受體酪氨酸磷酸化水平在CR組最高,C組居中,CT組最低,提示PTP1B活性在CT組、C組和CR組依次降低。 結(jié)論: 本研究首次發(fā)現(xiàn)PTP1B蛋白表達水平與3T3-L1脂肪細胞分化成熟度呈負相關, PTP1B對于脂肪組織分化成熟的直接作用是抑制性的;腫瘤壞死因子-α及羅格列酮對于機體包括脂肪組織胰島素敏感性的作用與其對脂肪細胞內(nèi)PTP1B水平的影響有一定關系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 李婷婷;FGF-21對糖吸收及胰島素抵抗的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2012年

2 李付娟;ADIPOQ基因?qū)ωi前體脂肪細胞分化的影響[D];吉林大學;2013年

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本文編號：1769334