本文選題：3T3-L1前脂肪細(xì)胞 + 脂肪分化�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 一、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)志物檢測(cè) 背景和目的: 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株,目前最常用的前脂肪細(xì)胞株之一,是一種從Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分離克隆獲得的具有脂肪細(xì)胞分化潛力的細(xì)胞株,在融合成單層的情況下具有自發(fā)分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力。該細(xì)胞株不但在體外經(jīng)誘導(dǎo)后可分化為成熟的脂肪細(xì)胞,而且植入小鼠體內(nèi)后也可分化并形成與正常脂肪組織無明顯差別的脂肪團(tuán)塊。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上類似于成纖維細(xì)胞,在經(jīng)歷了生長(zhǎng)停滯和克隆性擴(kuò)增后,在經(jīng)典的激素雞尾酒,即胰島素(insulin, INS)、地塞米松(dexamethasone, DEX)和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, MIX)的刺激下,前脂肪細(xì)胞逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐?細(xì)胞骨架以及細(xì)胞外基質(zhì)成分和水平發(fā)生變化,脂質(zhì)積聚,最終分化為成熟的脂肪細(xì)胞。由于3T3-L1前脂肪細(xì)胞可較好模擬脂肪細(xì)胞分化和活體脂肪組織的功能,因此目前已成為肥胖及體外脂肪細(xì)胞分化研究的一個(gè)常用工具。而如何在體外培養(yǎng)中,采用合適的培養(yǎng)條件、合理的培基配制及誘導(dǎo)劑的使用濃度對(duì)于脂肪細(xì)胞活力、生存狀態(tài)及其分泌能力都有重要的影響。本部分實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、脂肪含量等細(xì)胞生物學(xué)特性的研究,誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞,摸索培養(yǎng)和誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的最佳條件,為應(yīng)用藥物干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化以及后期研究3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)等奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的復(fù)蘇、體外培養(yǎng)、計(jì)數(shù)以及細(xì)胞凍存; 2、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化; 3、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞; 4、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisomal proliferation activated receptor-gamma , PPARγ2)基因表達(dá)變化。 結(jié)果: 1、采用含10%FBS、4mmol/l L-谷氨胺酰和100u/ml青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基成功進(jìn)行了3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的體外復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代; 2、在體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,采用傳統(tǒng)的雞尾酒誘導(dǎo)劑(0.5 mmol/L MIX、0.25 umol/ L DEX和10ug/ ml INS)成功地完成了3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。 3、油紅O染色顯示3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟過程中的脂滴形成情況,并證實(shí)3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。 4、PPARγ2 mRNA水平在3T3-L1前脂肪細(xì)胞(加入誘導(dǎo)劑開始誘導(dǎo)分化,D0)中表達(dá)極低,隨著誘導(dǎo)分化逐步成熟,其表達(dá)量逐步增加,至誘導(dǎo)分化D9~D10其表達(dá)量最高,提示脂肪細(xì)胞分化完全成熟。 結(jié)論: 本部分實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、脂肪含量等細(xì)胞生物學(xué)特性的研究,摸索出了培養(yǎng)和誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)劑濃度,油紅O染色以及脂肪細(xì)胞中PPARγ2基因表達(dá)的檢測(cè)均顯示3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟,為應(yīng)用藥物干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化以及后期研究3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)等奠定基礎(chǔ)。 二、3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化中PTP1B表達(dá)變化 背景和目的: 作為最早被純化的蛋白酪氨酸磷酸酶之一,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)一直被認(rèn)為是胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要負(fù)性調(diào)控因子,近年來更是成為治療肥胖、2型糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。 多項(xiàng)研究證實(shí),無論是基因敲除PTP1B還是PTP1B反義核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)處理均可使實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟和肌肉組織中胰島素受體后胰島素受體(insulin receptor, InsR)和胰島素受體底物蛋白(insulin receptor substrate protein, IRS)的磷酸化增強(qiáng),胰島素信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng),提高胰島素敏感性。然而,在同樣是胰島素主要作用靶點(diǎn)的脂肪組織的研究中,關(guān)于PTP1B對(duì)脂肪組織胰島素敏感性的影響則完全不同。在PTP1B基因敲除小鼠中,與肝臟及肌肉中胰島素受體磷酸化增強(qiáng)、胰島素敏感性提高相對(duì)應(yīng)的是,脂肪組織中胰島素受體的去磷酸化絲毫未受影響,無論是胰島素受體磷酸化的最大水平還是達(dá)到該最大水平所需時(shí)間都無變化。另外,以PTP1B ASO處理ob/ob小鼠可見到小鼠體重減低,參與脂肪合成的多種基因如固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein, SREBP-1)表達(dá)減少,成脂作用減弱;而與胰島素相關(guān)的蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)磷酸化無改變,脂肪細(xì)胞中胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無影響。而一項(xiàng)最新的研究又提示在脂肪組織中特異性敲除PTP1B基因可見到小鼠的體重增加。那么,PTP1B在脂肪細(xì)胞分化成熟中的作用到底是什么呢?我們首次采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞系,通過體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化,觀察脂肪細(xì)胞分化成熟過程中PTP1B表達(dá)變化,為進(jìn)一步揭示PTP1B在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積聚過程中的作用提供線索。 方法: 1、3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化; 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞; 3、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PTP1B mRNA表達(dá); 4、采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-FQ PCR )半定量檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PTP1B mRNA表達(dá); 5、采用western blot方法檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PTP1B蛋白水平表達(dá)。 結(jié)果: 1、在本實(shí)驗(yàn)中,我們成功培養(yǎng)了3T3-L1前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化成熟。 2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中PTP1B基因表達(dá)顯示,PTP1B mRNA表達(dá)在前脂肪細(xì)胞中(加入誘導(dǎo)劑,D0)最豐富,隨著誘導(dǎo)分化的逐漸成熟,其表達(dá)也逐步減低,至誘導(dǎo)第10天(D10)脂肪細(xì)胞完全成熟時(shí)降至最低點(diǎn)。其中D1~3、D4~8、D9~10各階段內(nèi)表達(dá)未見明顯差異,三組階段之間可見PTP1B mRNA表達(dá)差異顯著。 3、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-FQ PCR)半定量檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中第1~10天的PTP1B基因表達(dá)顯示,PTP1B mRNA表達(dá)在前脂肪細(xì)胞中最豐富,隨著誘導(dǎo)分化的逐漸成熟,其表達(dá)也逐步減低,至D10脂肪細(xì)胞完全成熟時(shí)降至最低點(diǎn)。 4、3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中,PTP1B蛋白表達(dá)情況與其mRNA表達(dá)相平行,在前脂肪細(xì)胞中最豐富,隨著誘導(dǎo)分化的逐漸成熟,蛋白水平逐步減低,至D9蛋白表達(dá)顯著減少,D10脂肪細(xì)胞完全成熟時(shí)表達(dá)最少。其中D1~3、D4~8各階段內(nèi)表達(dá)未見明顯差異,但D1~3、D4~8、D9和D10之間可見PTP1B蛋白表達(dá)差異顯著。 結(jié)論: 本研究首次發(fā)現(xiàn)在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟過程中,PTP1B mRNA及蛋白表達(dá)水平隨著脂肪細(xì)胞分化成熟而逐步減低,至脂肪細(xì)胞完全成熟時(shí)達(dá)到最低點(diǎn),提示PTP1B對(duì)于脂肪組織分化成熟的直接作用是抑制性的,PTP1B水平降低對(duì)于脂肪細(xì)胞分化成熟,脂質(zhì)積聚則起到了“允許”甚至是“促進(jìn)”作用。 三、腫瘤壞死因子-α及羅格列酮對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中PTP1B表達(dá)的影響 背景和目的: 已經(jīng)證實(shí),除了調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡外,脂肪組織,作為一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官,分泌多種激素和細(xì)胞因子如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子等,參與了機(jī)體更廣泛、更復(fù)雜、更重要的內(nèi)分泌代謝調(diào)控。越來越多的研究表明,脂肪細(xì)胞分化異常,而并非僅僅的脂肪組織過度生成,才是發(fā)生2型糖尿病、高血壓、冠心病等代謝性疾病的罪魁禍?zhǔn)�。與糖尿病、冠心病等密切相關(guān)的中央型肥胖很可能是由于脂肪組織分化異常,無法產(chǎn)生足夠數(shù)量的正常成熟脂肪細(xì)胞存儲(chǔ)過多的能量,進(jìn)而將生脂壓力轉(zhuǎn)嫁至肝臟、肌肉等器官,導(dǎo)致脂肪異位沉積,最終誘發(fā)一系列的代謝性疾患。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B,由于其可使胰島素受體(InsR)及胰島素受體底物蛋白(IRSs)等的酪氨酸脫磷酸化,一直被認(rèn)為是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控因子。然而,PTP1B在機(jī)體各組織中的作用存在著明顯的組織特異性。在肌肉、肝臟組織中已證實(shí)PTP1B水平降低,可使胰島素受體和胰島素受體底物蛋白磷酸化明顯增強(qiáng),反映胰島素敏感性的指標(biāo)如胰島素誘導(dǎo)的機(jī)體葡萄糖處置力(insulin stimulated whole-body glucose disposal, ISGD)顯著提升。而對(duì)于脂肪組織而言,PTP1B的作用目前仍不清楚,這些作用與機(jī)體胰島素敏感性之間的關(guān)系,更是不得而知。 為此我們采用體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞,觀察脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中PTP1B蛋白表達(dá)水平變化,再以羅格列酮和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)分別干預(yù)脂肪細(xì)胞分化成熟過程并觀察PTP1B蛋白表達(dá)情況,以期了解PTP1B在脂質(zhì)合成和成脂過程的作用以及羅格列酮及腫瘤壞死因子-α分別影響脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制。 方法: 1、3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化; 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞; 3、采用western blot方法檢測(cè)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化三組3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PTP1B蛋白水平表達(dá)。 4、采用免疫沉淀和western blot方法檢測(cè)三組3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟時(shí)胰島素受體表達(dá)及胰島素受體酪氨酸磷酸化水平。 結(jié)果: 1、在本實(shí)驗(yàn)中,我們成功建立了腫瘤壞死因子-α和羅格列酮干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的適當(dāng)工作濃度和條件。 2、三組3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中,與正常誘導(dǎo)組相比,羅格列酮干預(yù)組脂肪細(xì)胞分化得到促進(jìn),腫瘤壞死因子-α干預(yù)組則脂肪分化成熟受到抑制。 3、三組3T3-L1脂肪細(xì)胞分化成熟過程中,PTP1B蛋白表達(dá)趨勢(shì)均表現(xiàn)為在前脂肪細(xì)胞中最為豐富,并隨誘導(dǎo)分化成熟其表達(dá)逐步減少,至分化完全成熟時(shí)降至最低。但各組中PTP1B顯著降低的拐點(diǎn)有所不同,正常誘導(dǎo)組與腫瘤壞死因子-α干預(yù)組在加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化第9天(D9)出現(xiàn),羅格列酮干預(yù)組則出現(xiàn)在第8天(D8)。 4、比較三組脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后期第7至第10天(D7~D10)PTP1B蛋白水平變化,進(jìn)一步證實(shí)正常誘導(dǎo)組與腫瘤壞死因子-α干預(yù)組均在誘導(dǎo)分化第9天(D9)出現(xiàn)PTP1B蛋白表達(dá)水平顯著降低,而羅格列酮干預(yù)組在第8天(D8)即出現(xiàn)PTP1B蛋白表達(dá)水平顯著降低;PTP1B蛋白水平在腫瘤壞死因子-α干預(yù)組誘導(dǎo)分化第7天(D7)較同期正常誘導(dǎo)組顯著增加,羅格列酮干預(yù)組的第8天(D8)及第10天(D10)則較正常誘導(dǎo)組同期顯著減少,羅格列酮干預(yù)組的誘導(dǎo)分化后期第7至第10天(D7~D10)中PTP1B蛋白表達(dá)水平更是明顯低于腫瘤壞死因子-α干預(yù)組誘導(dǎo)分化的同期水平。 5、三組3T3-L1脂肪細(xì)胞分化成熟時(shí)胰島素受體蛋白水平無差異,而胰島素受體酪氨酸磷酸化水平在CR組最高,C組居中,CT組最低,提示PTP1B活性在CT組、C組和CR組依次降低。 結(jié)論: 本研究首次發(fā)現(xiàn)PTP1B蛋白表達(dá)水平與3T3-L1脂肪細(xì)胞分化成熟度呈負(fù)相關(guān), PTP1B對(duì)于脂肪組織分化成熟的直接作用是抑制性的;腫瘤壞死因子-α及羅格列酮對(duì)于機(jī)體包括脂肪組織胰島素敏感性的作用與其對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)PTP1B水平的影響有一定關(guān)系。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 李婷婷;FGF-21對(duì)糖吸收及胰島素抵抗的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 李付娟;ADIPOQ基因?qū)ωi前體脂肪細(xì)胞分化的影響[D];吉林大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1769334