發(fā)布時(shí)間：2018-04-15 05:19

  本文選題：RNAi + Argonaute2��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】：目的： RNAi是生物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)的重要方式。外源性的dsRNA.siRNA和內(nèi)源性的miRNA均可以做作為RNAi的觸發(fā)器,可以對(duì)同源靶RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大且特異性的剪切或抑制表達(dá)作用。RISC作為RNAi的效應(yīng)器,發(fā)揮靜默mRNA的作用。人類Argonaute2蛋白是人類Argonaute蛋白家族中已知的唯一在RNAi起作用的成員,是RISC的核心成分之一,與siRNA即可構(gòu)成最簡(jiǎn)單的效應(yīng)器發(fā)揮剪切靶mRNA的作用。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人類肺cDNA文庫(kù)中篩選得到了一系列可能與人類Argonaute2蛋白PIWI(?)吉構(gòu)域相互作用的蛋白,本文在前期工作的基礎(chǔ)上選擇了其中兩個(gè)蛋白DFFA、 PSMC3進(jìn)行深入研究,對(duì)其與Argonaute2蛋白的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,并研究了這兩個(gè)蛋白對(duì)RNAi的影響,以期進(jìn)一步深入了解RNAi的機(jī)制、探索RNAi可能的調(diào)控機(jī)制,為RNAi在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法： 選擇本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人類肺cDNA文庫(kù)中篩選得到的可能與人類Argonaute2蛋白PIWI結(jié)構(gòu)域相互作用的兩個(gè)蛋白DFFA、 PSMC3,利用免疫熒光技術(shù),觀察DFFA、PSMC3與AGO2蛋白在A549細(xì)胞內(nèi)的共定位。通過(guò)分別轉(zhuǎn)染DFFA.PSMC3表達(dá)質(zhì)粒和特異性siRNA干擾DFFA、 PSMC3的表達(dá)來(lái)研究在活細(xì)胞內(nèi)這兩個(gè)蛋白對(duì)RNAi的影響。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄生成靶mRNA,利用細(xì)胞提取物來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶nRNA的體外剪切,研究在細(xì)胞外這兩個(gè)蛋白對(duì)RNAi的影響。 結(jié)果： 1.免疫熒光證明DFFA、PSMC3與內(nèi)源性、外源性轉(zhuǎn)染的AGO2蛋白共定位于細(xì)胞漿中。 2. DFFA.PSMC3的過(guò)表達(dá)在siRNA量為100nM時(shí)對(duì)RNAi的影響不明顯,DFFA、PSMC3的過(guò)表達(dá)在siRNA量為50nM時(shí)對(duì)RNAi有促進(jìn)作用,用特異性siRNA干擾DFFA、PSMC3的表達(dá)可以抑制RNAi的效果。 3.通過(guò)體外剪切靶mRNA,證實(shí)了DFFA、PSMC3的過(guò)表達(dá)對(duì)RNAi的影響不明顯,特異性siRNA干擾DFFA、PSMC3的表達(dá)可以抑制RNAi的效果。 結(jié)論： 免疫熒光技術(shù)證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)DFFA、PSMC3與AG02蛋白存在共同定位,DFFA、PSMC3可以通過(guò)與AG02的相互作用影響RNAi、DFFA、PSMC3的過(guò)表達(dá)在siRNA飽和時(shí)對(duì)RNAi的影響不明顯,DFFA、PSMC3的過(guò)表達(dá)在siRNA不飽和時(shí)可以促進(jìn)RNAi的效果,DFFA、PSMC3的低表達(dá)可以抑制RNAi的效果。DFFA可能作為AG02蛋白的伴侶分子存在,參與AG02蛋白功能的正確發(fā)揮。PSMC3作為一種ATPase,兼有解旋酶的活性,則可能在RNAi過(guò)程中為siRNA的解旋提供能量,同時(shí)作為26S蛋白酶體的一部分,也有可能參與基因翻譯起始后抑制。這兩個(gè)與AG02蛋白相互作用蛋白的發(fā)現(xiàn)為RNAi調(diào)控機(jī)制提出了一種新的可能機(jī)制。
[Abstract]:Objective:RNAi is an important way to regulate gene posttranscriptional level in vivo.Exogenous dsRNA.siRNA and endogenous miRNA can both be used as triggers for RNAi, and can produce strong and specific splicing or inhibiting expression of RNA induced by homologous target. RISC acts as the effector of RNAi and plays the role of silent mRNA.Human Argonaute2 protein is the only known member of the human Argonaute protein family that functions in RNAi and is one of the core components of RISC. It can be used as the simplest effector to play the role of shearing target mRNA with siRNA.A series of human lung cDNA libraries were screened by yeast two-hybrid system in our laboratory. A series of possible connections with human Argonaute2 protein PIWII were obtained.Based on the previous work, two of the proteins, DFFA, PSMC3, were selected to further study the interaction with Argonaute2 protein, and the effects of these two proteins on RNAi were also studied.In order to further understand the mechanism of RNAi, explore the possible regulatory mechanism of RNAi, and provide a theoretical basis for the clinical application of RNAi.Methods:Two proteins, DFFA and PSMC3, which may interact with the PIWI domain of human Argonaute2 protein, were selected from human lung cDNA library by yeast two-hybrid system in our laboratory.The co-localization of DFFAP PSMC3 and AGO2 protein in A549 cells was observed.The effect of these two proteins on RNAi in living cells was studied by transfection of DFFA.PSMC3 expression plasmid and interference of PSMC3 and PSMC3 by specific siRNA.Target mRNAs were transcribed in vitro and the extracellular extracts were used to cut the target nRNA in vitro. The effects of these two proteins on RNAi were studied.Results:1.Immunofluorescence showed that DFFA-PSMC3 was co-located in cytoplasm with endogenous and exogenous AGO2 protein.2.The overexpression of DFFA.PSMC3 had no significant effect on RNAi when the amount of siRNA was 100nM. The overexpression of DFFA-PSMC3 could promote RNAi when the amount of siRNA was 50nM, and the effect of RNAi could be inhibited by the interference of siRNA with the expression of PSMC3 of DFFA-PSMC3.3.It was proved by cutting target mRNAs in vitro that the overexpression of DFFA-PSMC3 had no obvious effect on RNAi, and that the specific siRNA interference of DFFA-PSMC3 could inhibit the expression of RNAi.Conclusion:Immunofluorescence technique confirmed that the co-localization of DFFA-PSMC3 and AG02 protein in cells could influence the overexpression of DFFA-PSMC3 through the interaction with AG02. The over-expression of DFFA-PSMC3 was not obvious when siRNA was saturated. The overexpression of DFFA-PSMC3 could be promoted by siRNA unsaturated.Low expression of RNAi / PSMC3 inhibits the effect of RNAi. DFFA may be a chaperone of AG02 protein.Taking part in the proper function of AG02 protein .PSMC3, as a kind of Paseate, which has the activity of helicase, may provide energy for the unwinding of siRNA during the process of RNAi, as a part of 26s proteasome, and may also participate in the inhibition of gene translation after initiation.The discovery of these two interacting proteins with AG02 protein provides a new possible mechanism for the regulation of RNAi.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R3416

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6 馬s，

本文編號(hào)：1752689