本文選題：外周血單個核細胞 + 樹突狀細胞��； 參考：《中南大學》2007年博士論文

【摘要】： 目的樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是一種最具潛能的抗原提呈細胞,其對抗原進行捕獲、加工,處理后提呈給組織相容性復合物(majorhistocompability complex,MHC)-Ⅰ、Ⅱ類分子,誘導T淋巴細胞的增殖,在增強或調節(jié)細胞介導的免疫反應中起著決定性作用。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者DCs的相關研究目前愈來愈受到眾多學者的關注。本課題擬研究慢性乙型肝炎不同感染階段外周血來源DCs的功能特點,比較DCs中HBV不同滴度時DCs的功能差異,并研究CpG ODN能否促進DCs成熟,增強DCs功能,從而進一步揭示HBV感染不同狀態(tài)下DCs的免疫功能。 方法本研究對10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV攜帶者及10例健康對照者外周血來源DCs進行體外培養(yǎng),應用流式細胞技術檢測DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表達,ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清IL-12水平,以比較DCs在慢性乙型肝炎不同感染階段的功能特點;同時運用熒光定量PCR的方法,對12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內的HBV-DNA進行了檢測,并比較DCs中HBV不同滴度時DCs的功能差異;通過予以含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸鏈(unmethylated CpG motif containingoligodeoxynucleotides,CpG ODN)干預,研究CpG ODN能否有效促進DCs成熟,增強DCs功能。 結果 (1)實驗結果顯示,體外用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(加GM-CSF和IL-4)誘導人的外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)來培養(yǎng)DCs,24小時后可見貼壁單核細胞聚集成大小不等葡萄串狀,粘附于培養(yǎng)板底,第3天可見這部分細胞體積增大,第4天可見部分細胞懸浮于細胞培養(yǎng)液,第5天可見這部分細胞數(shù)目增多,部分細胞出現(xiàn)許多毛刺。第7天培養(yǎng)液中飄浮著大量有明顯樹突狀的大個細胞或細胞團。將培養(yǎng)7天的DCs收集在透射電鏡下觀察,每個視野充滿DCs,可見細胞體積較大,細胞表面突起比較豐富,胞漿內粗面內質網(wǎng)豐富,線粒體結構較清楚,溶酶體豐富,核大而圓,核膜清晰,染色質分布較均勻。慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者HLA-DR、CD80和CD86的表達率較正常對照組普遍降低,但HLA-DR、CD80和CD86的表達水平在慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者之間的差異無統(tǒng)計學意義。ELISA檢測培養(yǎng)第7天DCs上清IL-12水平,發(fā)現(xiàn)在DCs培養(yǎng)上清液中,IL-12的表達水平在慢性乙型肝炎患者及攜帶者明顯低于正常人,而慢性乙型肝炎患者與攜帶者之間則無明顯差異。 (2)對12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內的HBV-DNA進行檢測發(fā)現(xiàn):12例血清HBV-DNA陽性患者,其中有7例其DCs內可檢測到HBV-DNA,5例DCs內未檢出HBV-DNA,DCs內HBV-DNA檢出率為58.3%。流式細胞儀分析顯示,正常人的HLA-DR、CD80和CD86的表達陽性率均在58%以上,而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性組及血清HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達率較正常人組普遍降低,尤以血清HBV-DNA陽性組下降更為明顯。7例DCs HBV-DNA陽性組及15例DCs HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達率亦較正常人組普遍降低,尤以DCs HBV-DNA陽性組下降更為明顯。DCs培養(yǎng)上清IL-12水平在血清HBV-DNA陽性組明顯低于血清HBV-DNA陰性組及正常人組,血清HBV-DNA陽性組又低于血清HBV-DNA陰性組。而IL-12的表達水平在DCs HBV-DNA陽性組明顯低于DCs HBV-DNA陰性組及正常人組,DCs HBV-DNA陰性組又低于正常人組。相關分析顯示,DCs表面分子的表達及DCs分泌IL-12水平與血清及DCs HBV載量均呈顯著負相關。 (3)將培養(yǎng)第6天的DCs,加入CpG ODN繼續(xù)培養(yǎng)24小時后,透射電鏡觀察CpG ODN刺激后DCs與完全培養(yǎng)基對照組DCs相比,其表面的突起豐富、增粗,粗面內質網(wǎng)增多,空泡減少甚至消失。用流式細胞儀分析顯示,CpG ODN刺激組CD80、CD86及HLA-DR的表達陽性率在慢性乙型肝炎組、HBV攜帶者組及正常人組均完全培養(yǎng)基對照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對照組HLA-DR、CD86、CD80的表達陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組HLA-DR、CD86、CD80的表達陽性率較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。CpG ODN刺激組HLA-DR、CD86、CD80的表達陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組HLA-DR、CD86的表達陽性率較攜帶者組及正常人組明顯下降,但攜帶者組和正常人組之間比較卻無顯著性差異;慢性乙型肝炎組及攜帶者組CD80的表達陽性率正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。ELISA檢測CpG ODN刺激組及完全培養(yǎng)基對照組IL-12的水平,發(fā)現(xiàn)CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12的水平無論在慢性肝炎組、攜帶者組及正常人組均較完全培養(yǎng)基對照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對照組及CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12水平在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組DCs分泌IL-12水平較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。 結論(1)慢性乙型肝炎患者及無癥狀攜帶者均存在著DCs表型和功能的缺失。(2)慢性乙肝患者外周血DCs亦能受到HBV的感染,而且DCs的表型以及分泌IL-12能力與血清及DCs內HBV載量均呈顯著負相關關系。(3)CpG ODN能夠明顯促進慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟,為CpG ODN成為治療慢性乙型肝炎的一種新方法提供了實驗基礎。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R512.62;R392

【參考文獻】

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1 劉艷,楊寧,黃少萍,劉方舟,尹蘭珍;含未甲基化CpG寡脫氧核苷酸對人外周血樹突狀細胞抗腫瘤作用的影響[J];東南大學學報(醫(yī)學版);2004年04期

2 王良喜,周紅;CpG脫氧寡核苷酸的免疫活性[J];現(xiàn)代免疫學;2004年04期

3 鄭梅珍,蔣建偉;具有免疫刺激活性的非甲基化寡核苷酸鏈的研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2003年02期

4 向曉星,周霞秋,王俊學,謝青,蔡雄,俞紅,周惠娟;CpG-ODN聯(lián)合HBsAg對慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細胞表型和功能的影響[J];胃腸病學和肝病學雜志;2005年01期

5 段學章,王福生,王敏,莊輝,劉敬超;肝炎肝硬化患者外周血Ⅱ型樹突狀細胞數(shù)量和功能變化及意義[J];中華肝臟病雜志;2004年05期

6 高建,陳敏,彭明利,任紅;肝癌細胞裂解物致敏的樹突狀細胞瘤苗體外誘導特異性抗肝癌免疫[J];中華肝臟病雜志;2005年03期

7 姜榮龍 ,馮筱榕 ,郭亞兵 ,盧橋生 ,侯金林 ,駱抗先 ,富寧;T helper cells in patients with chronic hepatitis B virus infection[J];Chinese Medical Journal;2002年03期

8 韓亞萍,李軍,劉源,章莉莉,黃祖瑚;外周血樹突狀細胞免疫治療體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2005年08期

9 關心,彭吉潤,冷希圣;人樹突狀細胞與肝癌細胞系HLE融合細胞的構建[J];中華腫瘤雜志;2005年08期

10 ;病毒性肝炎防治方案 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯(lián)合修訂[J];肝臟;2000年04期

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本文編號：1752291