本文選題：外周血單個(gè)核細(xì)胞 + 樹突狀細(xì)胞　； 參考：《中南大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 目的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是一種最具潛能的抗原提呈細(xì)胞,其對(duì)抗原進(jìn)行捕獲、加工,處理后提呈給組織相容性復(fù)合物(majorhistocompability complex,MHC)-Ⅰ、Ⅱ類分子,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖,在增強(qiáng)或調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起著決定性作用。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者DCs的相關(guān)研究目前愈來愈受到眾多學(xué)者的關(guān)注。本課題擬研究慢性乙型肝炎不同感染階段外周血來源DCs的功能特點(diǎn),比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異,并研究CpG ODN能否促進(jìn)DCs成熟,增強(qiáng)DCs功能,從而進(jìn)一步揭示HBV感染不同狀態(tài)下DCs的免疫功能。 方法本研究對(duì)10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV攜帶者及10例健康對(duì)照者外周血來源DCs進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表達(dá),ELISA檢測(cè)DCs培養(yǎng)上清IL-12水平,以比較DCs在慢性乙型肝炎不同感染階段的功能特點(diǎn);同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR的方法,對(duì)12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行了檢測(cè),并比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異;通過予以含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸鏈(unmethylated CpG motif containingoligodeoxynucleotides,CpG ODN)干預(yù),研究CpG ODN能否有效促進(jìn)DCs成熟,增強(qiáng)DCs功能。 結(jié)果 (1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(加GM-CSF和IL-4)誘導(dǎo)人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)來培養(yǎng)DCs,24小時(shí)后可見貼壁單核細(xì)胞聚集成大小不等葡萄串狀,粘附于培養(yǎng)板底,第3天可見這部分細(xì)胞體積增大,第4天可見部分細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液,第5天可見這部分細(xì)胞數(shù)目增多,部分細(xì)胞出現(xiàn)許多毛刺。第7天培養(yǎng)液中飄浮著大量有明顯樹突狀的大個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。將培養(yǎng)7天的DCs收集在透射電鏡下觀察,每個(gè)視野充滿DCs,可見細(xì)胞體積較大,細(xì)胞表面突起比較豐富,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,線粒體結(jié)構(gòu)較清楚,溶酶體豐富,核大而圓,核膜清晰,染色質(zhì)分布較均勻。慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常對(duì)照組普遍降低,但HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)第7天DCs上清IL-12水平,發(fā)現(xiàn)在DCs培養(yǎng)上清液中,IL-12的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及攜帶者明顯低于正常人,而慢性乙型肝炎患者與攜帶者之間則無明顯差異。 (2)對(duì)12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn):12例血清HBV-DNA陽性患者,其中有7例其DCs內(nèi)可檢測(cè)到HBV-DNA,5例DCs內(nèi)未檢出HBV-DNA,DCs內(nèi)HBV-DNA檢出率為58.3%。流式細(xì)胞儀分析顯示,正常人的HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)陽性率均在58%以上,而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性組及血清HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常人組普遍降低,尤以血清HBV-DNA陽性組下降更為明顯。7例DCs HBV-DNA陽性組及15例DCs HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率亦較正常人組普遍降低,尤以DCs HBV-DNA陽性組下降更為明顯。DCs培養(yǎng)上清IL-12水平在血清HBV-DNA陽性組明顯低于血清HBV-DNA陰性組及正常人組,血清HBV-DNA陽性組又低于血清HBV-DNA陰性組。而IL-12的表達(dá)水平在DCs HBV-DNA陽性組明顯低于DCs HBV-DNA陰性組及正常人組,DCs HBV-DNA陰性組又低于正常人組。相關(guān)分析顯示,DCs表面分子的表達(dá)及DCs分泌IL-12水平與血清及DCs HBV載量均呈顯著負(fù)相關(guān)。 (3)將培養(yǎng)第6天的DCs,加入CpG ODN繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,透射電鏡觀察CpG ODN刺激后DCs與完全培養(yǎng)基對(duì)照組DCs相比,其表面的突起豐富、增粗,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多,空泡減少甚至消失。用流式細(xì)胞儀分析顯示,CpG ODN刺激組CD80、CD86及HLA-DR的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、HBV攜帶者組及正常人組均完全培養(yǎng)基對(duì)照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對(duì)照組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。CpG ODN刺激組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組HLA-DR、CD86的表達(dá)陽性率較攜帶者組及正常人組明顯下降,但攜帶者組和正常人組之間比較卻無顯著性差異;慢性乙型肝炎組及攜帶者組CD80的表達(dá)陽性率正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。ELISA檢測(cè)CpG ODN刺激組及完全培養(yǎng)基對(duì)照組IL-12的水平,發(fā)現(xiàn)CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12的水平無論在慢性肝炎組、攜帶者組及正常人組均較完全培養(yǎng)基對(duì)照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對(duì)照組及CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12水平在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組DCs分泌IL-12水平較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。 結(jié)論(1)慢性乙型肝炎患者及無癥狀攜帶者均存在著DCs表型和功能的缺失。(2)慢性乙肝患者外周血DCs亦能受到HBV的感染,而且DCs的表型以及分泌IL-12能力與血清及DCs內(nèi)HBV載量均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。(3)CpG ODN能夠明顯促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟,為CpG ODN成為治療慢性乙型肝炎的一種新方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R512.62;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1752291