本文選題：人源基因載體 + VEGF165��； 參考：《中南大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子具有特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘發(fā)新生血管生長(zhǎng)的作用。利用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因誘導(dǎo)治療性新生血管生成，從而治療缺血性心臟病和缺血性下肢疾病，是一種很有前景的方法。VEGF基因成功治療肢體血管閉塞癥和心臟缺血性疾病的臨床試驗(yàn)在國(guó)外已有較多的報(bào)道。 將外源基因VEGF導(dǎo)入到機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)是基因治療的前提，目前，已有很多種技術(shù)和方法可將外源基因轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中。病毒載體因其體內(nèi)、外轉(zhuǎn)染效率均較高，而成為在當(dāng)前VEGF基因治療的基礎(chǔ)和臨床研究中應(yīng)用得最多的載體。然而，病毒載體的安全性仍然是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。病毒載體的安全性問(wèn)題主要存在于兩個(gè)方面，首先，由于它們易被機(jī)體識(shí)別為異源物質(zhì)而可能具有免疫原性(immunogenicity)，另外一個(gè)更大的威脅是它可能將外源基因或者自身基因片段隨機(jī)插入到宿主基因轉(zhuǎn)錄與／或調(diào)控區(qū)域，造成宿主細(xì)胞正常功能基因的失活與某些沉默基因的激活，，從而可能引發(fā)腫瘤或其它疾病。因此，病毒載體并不是基因治療最理想的載體。醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人源基因載體—核糖體基因(rDNA)區(qū)靶向表達(dá)載體pHrneo能攜帶外源基因以較高的效率(10~(-4)-10~(-5))定點(diǎn)整合至人rDNA基因區(qū)。人每細(xì)胞有約600-800拷貝的rDNA基因，破壞一個(gè)拷貝對(duì)細(xì)胞維持正常的功能沒有影響，是安全的基因治療靶位點(diǎn)；而另一方面rDNA基因區(qū)編碼核糖體RNA(rRNA)，是轉(zhuǎn)錄異常活躍的染色體區(qū)域，外源基因整合于rDNA基因區(qū)可以有效的表達(dá)。因此，以人源基因載體pHrneo將外源基因VFGE定點(diǎn)整合于人rDNA基因區(qū)，將能實(shí)現(xiàn)外源基因安全、穩(wěn)定和有效的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)先成功地克隆出了VEGF基因片段，然后構(gòu)建了攜帶VEGF基因的人源基因載體pHrneo-VEGF165，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，測(cè)定定點(diǎn)整合及篩選定點(diǎn)細(xì)胞克隆，通過(guò)ELSA、RT-PCR、Western-blot等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)出了VEGF的定點(diǎn)表達(dá)，為利用VEGF基因治療缺血性心臟病和缺血性下肢疾病提供新的視角。
[Abstract]:Vascular endothelial growth factor (VEGF) can promote endothelial cell proliferation and induce neovascularization.Vascular endothelial growth factor (VEGF) gene was used to induce therapeutic neovascularization to treat ischemic heart disease and ischemic lower extremity disease.VEGF gene has been successfully used in the treatment of limb vascular occlusive disease and ischemic heart disease.The introduction of exogenous gene VEGF into organism or cell is the premise of gene therapy. At present, there are many techniques and methods to transfer exogenous gene into eukaryotic cells.Because of its high transfection efficiency in vivo and in vitro, virus vectors have become the most widely used vectors in the basic and clinical studies of VEGF gene therapy.However, the safety of virus vectors is still a problem that can not be ignored.The security problem of virus vector mainly exists in two aspects.Because they may be immunogenic because they are easily recognized as heterogenous substances, a greater threat is that they may be randomly inserted into the transcription and / or regulatory regions of host genes.Inactivation of normal functional genes and activation of some silencing genes in host cells may lead to tumor or other diseases.Therefore, viral vector is not the most ideal vector for gene therapy.The targeted expression vector pHrneo constructed by the State key Laboratory of Medical Genetics can carry foreign gene into human rDNA gene region with high efficiency.Human cells have about 600-800 copies of the rDNA gene per cell. Destroying one copy does not affect the normal function of the cell and is a safe target for gene therapy. On the other hand, the rDNA gene region encodes ribosomal RNA-rRNAs, which is a chromosomal region with abnormal transcriptional activity.The integration of exogenous genes into the rDNA gene region can be expressed effectively.Therefore, the integration of exogenous gene VFGE into human rDNA gene region by human gene vector pHrneo can realize the safe, stable and effective expression of exogenous gene.In this experiment, VEGF gene fragment was cloned successfully, and then the human gene vector pHrneo-VEGF165 was constructed. The constructed vector was transferred into the cells, and the targeted integration was determined and the targeted cell clone was screened. Western blot was used to detect the expression of pEGF165. by ELSART-PCRX Western-blot.The expression of VEGF was detected, which provided a new perspective for the treatment of ischemic heart disease and ischemic lower extremity disease with VEGF gene.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1736974