本文選題：小分子RNA + 寡核苷酸芯片��； 參考：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： microRNA(miRNA)是一種大小約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過(guò)Dicer酶加工而成，在線蟲(chóng)、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物都有發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，隨著對(duì)miRNA在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控作用的認(rèn)識(shí)，使得miRNA的研究倍受關(guān)注，并成為當(dāng)前生命科學(xué)理論和應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。在理論方面，重點(diǎn)研究miRNA如何通過(guò)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，在細(xì)胞分化、增殖和死亡、發(fā)育調(diào)控等方面發(fā)揮作用；在應(yīng)用方面，以miRNA為靶向的小分子RNA藥物正在成為生物藥物開(kāi)發(fā)新熱點(diǎn)，而組織特異性miRNA表達(dá)譜有可能成為腫瘤診斷、分級(jí)、分類(lèi)與預(yù)后的新標(biāo)志。 一、miRNA在胚胎脊髓發(fā)育中作用機(jī)制的研究 目的：篩選并鑒定胚胎脊髓組織中特異性miRNA，分析其在脊髓神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖和發(fā)育過(guò)程中的基本功能，為深入研究胚胎神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和畸形形成機(jī)制提供基礎(chǔ)。 方法：首先應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)分析人12孕周和24孕周流產(chǎn)胎兒不同器官的全基因組miRNA表達(dá)譜，通過(guò)Northern Blot和聚類(lèi)分析確定脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性miRNA；通過(guò)全反式維甲酸(RA)誘導(dǎo)建立大鼠胚胎脊柱裂動(dòng)物模型，根據(jù)大鼠胚胎發(fā)育情況，分別在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎，采用miRNA組織細(xì)胞原位雜交和Northern Blot等方法檢測(cè)脊髓發(fā)生過(guò)程中miRNA的表達(dá)情況，分析脊髓組織特異miRNA在神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖和發(fā)育中的作用。 結(jié)果： (1)分別構(gòu)建了12周和24周人胚心臟、肝、腎、肺、腦、脊髓等組織器官的全基因組miRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示158種人源miRNA的72％-83％在胚胎組織器官中表達(dá)，且相同發(fā)育階段的不同組織器官miRNA表達(dá)譜不同，而不同發(fā)育階段的相同組織器官，miRNA表達(dá)譜也不同；通過(guò)聚類(lèi)分析，首次發(fā)現(xiàn)mir-9／9~*僅在人胎兒神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，包括大腦和脊髓，以及miR-124a、miR-125b和miR-128等三種與mir-9／9~*協(xié)同表達(dá)的胚胎神經(jīng)系統(tǒng)特異miRNA。 (2)在RA誘導(dǎo)的脊柱裂大鼠脊髓細(xì)胞凋亡明顯增加，表明RA處理可誘導(dǎo)胚胎發(fā)育晚期脊髓細(xì)胞的非正常死亡；Bcl-2與miR-9／9~*以及P53與miR-124a／125b具有相同的時(shí)空表達(dá)模式；且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)中miR-124a／125b表達(dá)缺失。 結(jié)論： (1)本論文在大腦、脊髓等人胚胎神經(jīng)系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜，提示miRNA在人胚胎大腦和脊髓發(fā)育過(guò)程中起重要作用。 (2)本論文發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)脊髓特異性miRNA表達(dá)下調(diào)主要為時(shí)空表達(dá)模式的失調(diào)，提示這些miRNA有可能通過(guò)RA誘導(dǎo)下調(diào)，進(jìn)而影響脊髓的正常發(fā)育或誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡；此外，本研究結(jié)果還顯示miR-9／9~*和miR-124a／125b可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和P53通路，在感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。 二、miRNA用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分類(lèi)研究 目的：以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤為對(duì)象，篩選并構(gòu)建腫瘤組織特異性miRNA表達(dá)譜，研究其作為腫瘤分級(jí)、分類(lèi)及預(yù)后分子標(biāo)志的可行性。 方法：根據(jù)WHO臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)收集新鮮的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本，通過(guò)福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)制作組織芯片(TMA)，采用miRNA芯片、組織細(xì)胞原位雜交(ISH)和Northern Blot等方法確定腫瘤組織miRNA表達(dá)特征，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)記，包括Ki-67、VEGF和GFAP等在腫瘤組織的定位與表達(dá)情況，通過(guò)聚類(lèi)分析構(gòu)建腫瘤組織miRNA特異性表達(dá)譜。 結(jié)果： (1)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究結(jié)果顯示，人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中miR-9和miR-21表達(dá)的增加，而miR-124a、miR-125b表達(dá)的減少，結(jié)合病理診斷，發(fā)現(xiàn)組織特異性miRNA表達(dá)模式與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理分級(jí)相關(guān)；此外，miRNA總體表達(dá)水平與Ki-67、VEGF以及GFAP標(biāo)志物之間呈負(fù)相關(guān)。 (2)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征研究結(jié)果顯示，腫瘤組織基因組miRNA整體表達(dá)水平高于正常對(duì)照，有11種miRNA表達(dá)水平超過(guò)正常視網(wǎng)膜組織的2倍(N／T＜0.5)，其中表達(dá)水平高于正常水平4倍的有miR-373*、miR-503和miR-320；該結(jié)果與Northern Blot和組織細(xì)胞原位雜交結(jié)果一致。 結(jié)論： (1)根據(jù)本論文對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究結(jié)果表明，miRNA是一類(lèi)不同于現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物的新型分級(jí)、分類(lèi)標(biāo)志物，同時(shí)結(jié)合臨床病程、病理診斷以及聚類(lèi)分析，，提示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征也可用于預(yù)后以及放、化療敏感性或耐藥性的判定，并特別提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵標(biāo)志物。 (2)在對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究中，首次發(fā)現(xiàn)腫瘤基因組miRNA整體表達(dá)水平增高，提示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制可能與其他實(shí)體瘤不同，其中miR-373*、miR-503和miR-320表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他miRNA，提示其可能是在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用的調(diào)控分子。
[Abstract]:MicroRNA (miRNA) is a small single stranded RNA a size of approximately 21~23 bases, with hairpin structure about 70-90 nucleotides of single stranded RNA precursor (pre-miRNA) after Dicer enzyme processing, online insects, plants, insects and mammals are found. In recent years, with the understanding of expression regulation the miRNA in the biological process of the ontogeny of gene, makes miRNA research paid much attention, and become the focus of life science research in theory and application. In the aspect of theory, focusing on how miRNA through the regulation of gene expression in post transcriptional, in cell differentiation, proliferation and death, play a role in the regulation of development and other aspects; applications to miRNA targeted small molecule drug RNA is becoming a new hotspot of biological drug development, and tissue specific expression pattern of miRNA may be a tumor diagnosis, classification, classification and prognosis of the new logo.
The study of the mechanism of miRNA in the development of embryonic spinal cord
Objective: to screen and identify specific miRNA in embryonic spinal cord, and analyze its basic functions in differentiation, proliferation and development of spinal cord neurons, so as to provide a basis for further research on the normal development and malformation mechanism of embryonic nervous system.
Methods: whole genome miRNA first application analysis of different organs of 12 weeks and 24 weeks of gestation fetal oligonucleotide microarray expression profiles determined by Northern Blot analysis and cluster analysis of spinal cord central nervous system specific miRNA; by all trans retinoic acid (RA) induced by establishing rat embryonic spinal bifida animal model, according to the rat embryos, embryos at days 13.5,15.5,17.5 and 19.5 respectively, the expression of miRNA cells by in situ hybridization and Northern Blot method for the detection of spinal cord during the process of miRNA, analysis of spinal cord tissue specific miRNA in neural cell differentiation, proliferation and development role.
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本文編號(hào)：1731671