本文關(guān)鍵詞： 桿狀病毒 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 基因轉(zhuǎn)移載體 人乳頭瘤病毒 病毒滴度　出處：《廈門大學(xué)》2006年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： HPV感染是常見(jiàn)的性傳播疾病,與宮頸癌及泌尿生殖道相關(guān)癌癥的發(fā)生關(guān)系密切,嚴(yán)重危害人類健康。開(kāi)發(fā)安全有效的HPV預(yù)防疫苗有望消滅或顯著降低HPV感染造成的危害,具有十分重大的社會(huì)意義。我實(shí)驗(yàn)室正在研究開(kāi)發(fā)HPV基因工程疫苗,迫切需要可簡(jiǎn)便有效對(duì)候選疫苗的保護(hù)性進(jìn)行評(píng)估的方法。目前的HPV體外感染模型在實(shí)驗(yàn)周期、穩(wěn)定性、滴度等方面存在各自的缺點(diǎn),而新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展為構(gòu)建更有效的感染模型提供了有利條件。桿狀病毒近幾年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可作為一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的新型基因轉(zhuǎn)移載體,相比其它基因轉(zhuǎn)移方法具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本論文即探討了應(yīng)用重組桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建HPV假病毒的可行性。為了更有效的獲得HPV假病毒本論文對(duì)重組桿狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行了研究,建立了更為簡(jiǎn)便、快捷且高效的基因轉(zhuǎn)移方法。該方法被成功用于建立了有效的HPV16假病毒體外感染模型,以及鑒定桿狀病毒滴度的新方法。 本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP和CMV-T7聯(lián)合啟動(dòng)子構(gòu)建對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體,首先探討了直接使用重組桿狀病毒感染后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的可行性。將重組桿狀病毒感染4d后的Sf-9細(xì)胞培養(yǎng)上清(≥1.0×10~7PFU/mL)直接與HepG2細(xì)胞37℃作用12h,可獲得高于95%的基因轉(zhuǎn)移效率,證明了重組桿狀病毒感染后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接用于高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和稀釋比例的優(yōu)化,顯示用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基等體積稀釋后的帶毒上清可兼具高效和低損傷的特點(diǎn)。應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并初步建立了重組桿狀病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法。該方法與脂質(zhì)體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘苗病毒進(jìn)行的對(duì)比顯示其具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用該方法對(duì)27種不同類型及組織來(lái)源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),包括16種人類組織細(xì)胞、9種嚙齒類組織細(xì)胞和2種猴組織細(xì)胞,結(jié)果顯示該方法具有較好的適用性,可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。并發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒對(duì)靈長(zhǎng)類來(lái)源細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對(duì)嚙齒類來(lái)源細(xì)胞,對(duì)貼壁細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對(duì)懸浮細(xì)胞。 結(jié)合最新的研究進(jìn)展,本研究進(jìn)一步對(duì)病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索優(yōu)化,并嘗試采用新方法提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。對(duì)使用不同的稀釋緩沖液和轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度的研究結(jié)果顯示,以PBS作為稀釋緩沖液在27℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在PBS環(huán)境中對(duì)比不同轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和稀釋比例以及不同血清含量對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果的影響結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和病毒用量均呈正相關(guān),并首次發(fā)現(xiàn)PBS中存在血清成分不利于提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。應(yīng)用不同濃度丁酸鈉增強(qiáng)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,0.5～1mM的丁酸鈉較為合適于在CV1細(xì)胞中提高桿狀病毒載體的表達(dá)效率,更高濃度的丁酸鈉對(duì)細(xì)胞有明顯毒性。本研究首次在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用離心方法,結(jié)果顯示通過(guò)600g水平離心1h即可獲得高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率,優(yōu)于在PBS環(huán)境中27℃孵育8h的效果,并進(jìn)一步對(duì)離心時(shí)間、離心后孵育時(shí)間、緩沖液進(jìn)行了摸索優(yōu)化。 應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并建立了重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法。病毒上清以PBS為緩沖環(huán)境600g水平離心1h進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法可在獲得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的同時(shí)顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,提高了實(shí)驗(yàn)效率。該方法具有簡(jiǎn)便、快捷和高效的特點(diǎn),并可作為一種常規(guī)操作方法用于日常實(shí)驗(yàn)。本研究同時(shí)探討了輔助感染可表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VV-T7RP對(duì)表達(dá)的影響,顯示輔助感染VV-T7RP可顯著增強(qiáng)帶有CMV-T7聯(lián)合啟動(dòng)子的重組桿狀病毒的表達(dá)效果,表明將重組痘苗病毒VV-T7RP與重組桿狀病毒結(jié)合可建立一種高效瞬時(shí)表達(dá)方法。 本研究首次設(shè)計(jì)構(gòu)建了可同時(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)HPV16L1和L2蛋白的重組桿狀病毒,并采用本研究建立的重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法,探討了通過(guò)重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)組裝HPV16假病毒的可行性。細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察結(jié)果證實(shí),通過(guò)該方法成功獲得了具有感染能力的HPV16假病毒。應(yīng)用已被證實(shí)的4株HPV16單抗,證明該假病毒感染模型可應(yīng)用于進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用該模型,從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的18株HPV16單抗中篩選獲得2株中和單抗3D10和PD1,同時(shí)證明本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的候選基因工程疫苗HPV16 VLP可激發(fā)Balb/c小鼠產(chǎn)生具有中和能力的保護(hù)性體液免疫。該模型的成功建立為HPV16中和抗體的篩選和HPV16預(yù)防疫苗的研究提供了必要的條件和有力的支持,也為進(jìn)一步構(gòu)建其它型別的HPV假病毒體外感染模型提供了基礎(chǔ)。本研究還首次嘗試了使用HPV16假病毒對(duì)昆蟲細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn),顯示HPV16假病毒可能具有將核酸導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的能力。 大量的關(guān)于重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用研究實(shí)踐顯示,準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度對(duì)于保持蛋白生產(chǎn)和研究實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性是十分重要的。本研究綜合了應(yīng)用重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)以及輔助感染VV-T7RP可顯著增強(qiáng)CMV-T7聯(lián)合啟動(dòng)子表達(dá)水平的特點(diǎn),提出了新型的可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定重組桿狀病毒滴度的方法。本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了同時(shí)具有在昆蟲細(xì)胞中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)報(bào)告基因的重組桿狀病毒。應(yīng)用該病毒首先在昆蟲細(xì)胞中準(zhǔn)確測(cè)定滴度,再通過(guò)梯度稀釋后離心轉(zhuǎn)導(dǎo)CV1細(xì)胞并輔助感染VV-T7RP,在12～24h后直接觀察細(xì)胞發(fā)光情況,以TCID_(50)方法計(jì)算病毒滴度。結(jié)果顯示,以CMV-T7聯(lián)合啟動(dòng)子引導(dǎo)的EGFP報(bào)告基因表達(dá)元件在VV-T7RP輔助下具有最高的檢測(cè)靈敏度,其測(cè)得的滴度與昆蟲細(xì)胞中測(cè)得的滴度相當(dāng),優(yōu)于單獨(dú)使用CMV啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。本研究首次提出了可將CMV-T7-EGFP表達(dá)元件作為一種優(yōu)良的病毒滴度鑒定元件克隆于桿狀病毒載體上,其在昆蟲細(xì)胞中不會(huì)進(jìn)行有效表達(dá)和干擾重組蛋白和病毒的生產(chǎn),同時(shí)又可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行高靈敏度和快速、直觀的檢測(cè),不需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。該方法為重組桿狀病毒滴度的測(cè)定提供了一種選擇。
[Abstract]:HPV infection is a common sexually transmitted disease , which is closely related to the occurrence of cervical cancer and related cancers of the urinary tract . It is of great social significance to develop a safe and effective HPV vaccine to prevent or significantly reduce the risk of HPV infection . In this study , the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was investigated . The results showed that the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was higher than that in HepG2 cells . In this study , the effect of different signal transduction time and dilution ratio and different serum levels on the transduction efficiency was studied . The results showed that the transfection efficiency was positively correlated with the time of transduction and the dosage of virus . The results showed that the transfection efficiency was better than that in PBS . The results showed that 0.5 锝，

本文編號(hào)：1510132