發(fā)布時間：2018-02-08 09:06

  本文關(guān)鍵詞： 超抗原 SEA T細(xì)胞 增殖 無能　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 超抗原是一類強大的免疫激活劑,它無需抗原提呈細(xì)胞的加工處理,而是以完整的蛋白質(zhì)形式結(jié)合于MHC-Ⅱ類分子溝槽外側(cè),激活大量的T細(xì)胞,同時產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。超抗原的這種高效免疫活性,使其成為一種新的腫瘤免疫治療模式。我們的實驗室多年來一直致力于腫瘤免疫治療的研究,通過克隆SEA基因,對SEA進(jìn)行原核表達(dá)、分離純化,制備了活性較高的SEA蛋白;利用納米乳劑為載體包裹腫瘤特異性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白與SEA配比制備出一種新型腫瘤納米疫苗,并研究了其理化和生物學(xué)特性以及抗腫瘤免疫效應(yīng);同時構(gòu)建了肝癌靶向性SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體,在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其能有效地激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 但是在進(jìn)一步的研究中人們發(fā)現(xiàn),超抗原的多次刺激導(dǎo)致了T細(xì)胞的免疫耐受,即一部分抗原特異性的T細(xì)胞發(fā)生程序性死亡,余下的抗原反應(yīng)性T細(xì)胞對超抗原的再次刺激表現(xiàn)為無反應(yīng)性,即無能。超抗原的這一特性給人們帶來了負(fù)面影響,限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用,因此超抗原的理論和作用機制的研究又成為熱點。但是要想將超抗原SEA免疫治療應(yīng)用于臨床,只研究理論機制是不夠的,超抗原本身的劑量、途徑和使用方法等對體內(nèi)外T細(xì)胞免疫效應(yīng)的正負(fù)影響及規(guī)律,對于SEA的臨床實際應(yīng)用同樣具有重要的指導(dǎo)意義,而這在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)地研究報道,也是我們研究腫瘤超抗原疫苗的一個空缺。因此本研究的目的就是通過建立小鼠體內(nèi)和體外無能T細(xì)胞模型,從增殖反應(yīng)、細(xì)胞膜表型變化和細(xì)胞因子的合成與釋放等方面系統(tǒng)全面地探討超抗原SEA影響T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的量效關(guān)系及規(guī)律特點,為超抗原在腫瘤臨床免疫治療中的合理而有效地應(yīng)用提供理論依據(jù)。實驗內(nèi)容主要概括如下: 1.超抗原SEA對小鼠脾淋巴細(xì)胞活化和增值的體內(nèi)外影響 目的:分別用SEA單次刺激體內(nèi)或體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞,觀察SEA促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化和增殖的規(guī)律和特點。方法:①采用MTT法測定SEA刺激后脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。②通過FACS檢測SEA初次刺激后脾淋巴細(xì)胞膜表型的變化。③用CTLL-2細(xì)胞測定細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清中IL-2的活性,并用FACS檢測細(xì)胞內(nèi)IL-2的水平。結(jié)果:在體外,使脾淋巴細(xì)胞顯著增殖的SEA濃度范圍是1-1000ng/ml,選擇100ng/ml作為觀察SEA體外刺激能力的最佳劑量,其既能刺激T細(xì)胞的顯著增殖,又不會導(dǎo)致過早的細(xì)胞死亡。在體內(nèi),根據(jù)對T細(xì)胞刺激程度和效力維持時間,選擇腹腔注射為最佳注射途徑;SEA劑量在5-15μg范圍內(nèi)均能促進(jìn)CD3表達(dá)顯著上升,最佳劑量為10μg。體內(nèi)外結(jié)果均顯示,SEA單次刺激促進(jìn)了T細(xì)胞活化的主要膜表面分子(CD69和CD25)的表達(dá)顯著升高,使CD4與CD8的表達(dá)同步上升,IL-2的合成和釋放快速增加。結(jié)論:在一定濃度范圍內(nèi)的SEA對體內(nèi)外的T細(xì)胞均具有強烈的活化和增殖作用,其對CD4和CD8亞群具有相同的增殖效果。為下一步研究超抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的實驗提供依據(jù)和設(shè)計思路。 2.超抗原SEA誘導(dǎo)T細(xì)胞無能的體內(nèi)外研究 目的:建立T細(xì)胞無能的小鼠體內(nèi)和體外模型,觀察超抗原SEA反復(fù)刺激誘導(dǎo)無能T細(xì)胞的規(guī)律和特點。方法:①在體外,用MTT法測定間隔48h多次SEA刺激后的脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng);在體內(nèi),間隔不同天數(shù)反復(fù)注射SEA后,通過FACS檢測脾淋巴細(xì)胞中CD3的表達(dá)。②通過FACS分析SEA反復(fù)刺激后,體內(nèi)外淋巴細(xì)胞膜表型CD4、CD8、CD69和CD25的變化。③測定細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清中細(xì)胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10、)的水平,及細(xì)胞內(nèi)IL-2和IL-10的陽性百分率。④在不同時間點,SEA再刺激體外或體內(nèi)誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞,通過MTT法的測定觀察其反應(yīng)性的恢復(fù)情況。 結(jié)果:①經(jīng)SEA初次刺激后的體內(nèi)或體外培養(yǎng)的T細(xì)胞,對SEA的再刺激仍顯示有繼續(xù)增殖的能力。在體外,刺激T細(xì)胞第二次增殖的SEA最佳濃度為100ng/ml。與SEA初次刺激相比,細(xì)胞膜表型CD8表達(dá)上升的幅度顯著高于CD4,CD69的表達(dá)沒有明顯上升,但仍保持在較高的水平;細(xì)胞因子IL-4和IL-10的含量均顯著升高。在體內(nèi),間隔不同的天數(shù),SEA體內(nèi)第二次注射均可引起CD3表達(dá)升高。間隔3天組中,SEA的再注射主要促進(jìn)了CD4表達(dá)的上升;間隔28天組中CD4和CD8的表達(dá)均有上升,且趨勢相近。與SEA初次注射相比,血清及細(xì)胞內(nèi)IL-2的水平仍有小幅度的遞增,IL-10水平則顯著上升。體內(nèi)外,連續(xù)兩次SEA刺激均能導(dǎo)致CD25不同程度的表達(dá)升高。②在體外,T細(xì)胞受間隔48h連續(xù)三次SEA刺激后,無明顯的增殖反應(yīng);CD4和CD8的表達(dá)沒有繼續(xù)上升;CD69的表達(dá)顯著下降;而CD25的表達(dá)在末次刺激后48h內(nèi)保持在較高的水平。在體內(nèi),間隔不同天數(shù)的SEA連續(xù)三次注射后,小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3的表達(dá)均有不同程度的下降。各組中CD8的表達(dá)水平基本相似,CD4和CD25卻有明顯的不同:間隔3天組中,CD4的表達(dá)在末次注射后3天內(nèi)明顯降低;CD25沒有上升的趨勢,但在末次注射后3天內(nèi)仍保持一定水平的表達(dá)。間隔28天組中,CD4的表達(dá)較穩(wěn)定,沒有顯著的升降;CD25的表達(dá)水平較低。體內(nèi)外均發(fā)現(xiàn),經(jīng)SEA多次刺激后,僅IL-10的水平仍繼續(xù)上升。③體外培養(yǎng)的無能T細(xì)胞在7天內(nèi)幾乎沒有增殖能力,21天后增殖能力顯著提高,接近正常水平。在體內(nèi),間隔3天組和間隔28天組中誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞分別從末次注射后第21天和第28天開始出現(xiàn)較弱的應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)論:①首次在C57BL/6小鼠體內(nèi)外成功建立了無能T細(xì)胞模型。但體內(nèi)外誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞經(jīng)過一段時間的休息,其應(yīng)答反應(yīng)是可以逐漸恢復(fù)的。②經(jīng)SEA初次刺激的T細(xì)胞,對SEA的再刺激,仍具有潛在的增殖反應(yīng)。在體外,SEA的第二次刺激主要促進(jìn)CD8亞群的增殖;在體內(nèi),首次證實間隔較短時間的連續(xù)兩次SEA注射主要促進(jìn)了CD4亞群的增殖,而間隔較長時間的兩次SEA注射則對CD4和CD8亞群產(chǎn)生相似的增殖效果。③在體內(nèi)實驗中,首次證實了注射間隔時間的長短與無能的觸發(fā)無關(guān),但影響了CD4亞群的克隆清除,即間隔時間越短,被清除的CD4+T細(xì)胞越多;間隔時間越長,CD4+T細(xì)胞清除的程度越小。④在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn),盡管CD25的高表達(dá)與無能的誘導(dǎo)密切相關(guān),但不是絕對的,即在CD25低表達(dá)的情況下也可觸發(fā)T細(xì)胞無能,并且CD25可能不參與無能狀態(tài)的維持。⑤體內(nèi)外試驗均證實IL-10水平的升高與誘導(dǎo)T細(xì)胞無能密切相關(guān),還可能與無能T細(xì)胞的維持有關(guān)。 3.超抗原SEA誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)外T細(xì)胞無能過程中CD28/CTLA-4的變化 目的:在超抗原SEA誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)外T細(xì)胞無能的過程中,觀察CD28和CTLA-4變化規(guī)律及相互關(guān)系。方法:SEA體內(nèi)或體外單次或多次刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后,通過FACS檢測細(xì)胞膜表面CD28和CD152(CTLA-4)陽性表達(dá)率,及胞內(nèi)CTLA-4的表達(dá)。結(jié)果:體外和體內(nèi)的結(jié)果相似:SEA初次刺激后,CD28的表達(dá)顯著上升;而CTLA-4在胞內(nèi)和膜表面的表達(dá)均低。SEA再次刺激后,CD28的表達(dá)繼續(xù)上升;CTLA-4的表達(dá)明顯增加,胞內(nèi)CTLA-4的升高尤為顯著。SEA連續(xù)三次刺激后,CD28的表達(dá)顯著降低;CTLA-4在膜表面和胞內(nèi)的表達(dá)均開始下降。結(jié)論:CTLA-4的負(fù)調(diào)節(jié)作用限制了CD28的表達(dá),抑制T細(xì)胞的繼續(xù)活化,有利于無能的誘導(dǎo);但CTLA-4在SEA反復(fù)刺激后的表達(dá)下調(diào),提示其可能不參與無能T細(xì)胞的維持。 上述研究顯示,超抗原SEA誘導(dǎo)的機體免疫反應(yīng)是一個有規(guī)律的變化過程,在腫瘤免疫治療中猶如一把雙刃劍,當(dāng)人們正確掌握了它的合適劑量、給藥間隔時間以及給藥方式的規(guī)律,應(yīng)該說SEA仍然是當(dāng)前抗腫瘤的一個有力武器。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1495095