本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 體外培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化 肝細(xì)胞生長因子 表皮細(xì)胞生長因子 肝細(xì)胞　出處：《江西醫(yī)學(xué)院》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:建立一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)體外培養(yǎng)方法,探討肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)誘導(dǎo)MSCs 向肝細(xì)胞定向分化的可行性。方法:用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓中的MSCs,接種于含10%胎牛血清的L-DMEM 培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞基本融合后用胰蛋白酶和EDTA 混合液消化傳代。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)細(xì)胞并繪制生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。取第三代人MSCs 分別在含HGF、EGF、HGF+EGF 以及不含生長因子的無血清肝細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,于誘導(dǎo)培養(yǎng)的第1、7、14、21、28 天取出細(xì)胞爬片,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)的表達(dá),PAS 法進(jìn)行糖原染色試驗,并收集培養(yǎng)上清液用全自動生化分析儀檢測ALB 和BUN的含量。結(jié)果:1、采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可成功分離出人骨髓中的MSCs。剛接種時細(xì)胞形態(tài)呈圓形、三角形或棒桿狀,48h 后細(xì)胞開始貼壁,4-5d 可見有集落形成,第7d 形成多個細(xì)胞克隆,第10d 細(xì)胞呈長梭形,2w 左右可達(dá)到基本融合;傳代細(xì)胞呈均勻的紡錘形,基本上無懸浮細(xì)胞。生長曲線呈現(xiàn)生長緩滯期、對數(shù)增殖期和生長平穩(wěn)期的典型特征。流式細(xì)胞儀檢測顯示約有86.4%的細(xì)胞處于G0、G1 期。2、接種于含HGF、EGF 和HGF+EGF 無血清肝細(xì)胞培養(yǎng)基中的MSCs 于誘導(dǎo)第5 天均可觀察到部分紡錘形細(xì)胞逐漸變圓,換液的同時誘導(dǎo)孔中細(xì)胞數(shù)目略有減少;第10 天左右基本
[Abstract]:Objective: to establish a culture method of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro and to investigate the expression of hepatocyte growth factor (HGF). The feasibility of inducing MSCs to differentiate into hepatocytes by epidermal growth factor (EGF). Methods: MSCs was isolated from bone marrow by Ficoll lymphocyte isolate. Primary culture was carried out in L-DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After cell fusion, trypsin and EDTA mixture were used for digestion and passage. Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope. Trypan blue exclusion method was used to count cells and draw growth curve. Flow cytometry was used to detect the cell cycle. The third generation of human MSCs was detected with HGF EGF. HGF EGF and serum-free hepatocyte medium without growth factor were cultured. The morphological changes of the cells were observed under inverted phase contrast microscope. Cell climbing tablets were taken out for 28 days. The expression of AFPU, ALBN and CK18 were detected by immunocytochemical method in Afetoprotein A (AFP), Albumin (ALBN) and cytokeratin (CK-18). The glycogen staining test was carried out by PAS, and the supernatant of culture was collected and the contents of ALB and BUN were detected by automatic biochemical analyzer. Results: 1. MSCs in human bone marrow could be successfully isolated by density gradient centrifugation and adherent culture. The cells were round in shape at first inoculation, and the cells began to adhere to the wall after 48 hours of triangular or rod-shaped cells. Colony formation was observed at 4-5 days, multiple cell clones were formed on the 7th day, and the cells were fusiform for about 2w on the 10th day. The passage cells showed a uniform spindle shape and basically no suspension cells. The growth curve showed a slow growth phase. The typical characteristics of logarithmic proliferative phase and growth stationary phase. Flow cytometry showed that about 86.4% cells were in G _ 0 / G _ 1 phase and inoculated with HGF. MSCs in EGF and HGF EGF serum-free hepatocytes culture medium could be observed on the 5th day after induction. At the same time, the number of cells in the orifices decreased slightly. About the tenth day
【學(xué)位授予單位】：江西醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R329.2

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本文編號：1462181