本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及生物學(xué)特性探討　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的:在體外將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)進(jìn)行純化、擴增及向心肌樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行心肌樣細(xì)胞相關(guān)特性分析并探討體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向心肌樣細(xì)胞分化過程中分化與凋亡的情況,檢測分化過程中心肌細(xì)胞特征表達(dá)及膜電位變化的情況,為hMSCs臨床移植治療提供實驗參考依據(jù)。 方法: (1)采用體外純化、擴增后的第4代hMSCs在體外經(jīng)5μmol.l-1 5-雜氮胞苷誘導(dǎo)24小時后繼續(xù)培養(yǎng)8周,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,免疫組化方法鑒定心肌特異性蛋白心房鈉尿肽(ANP)和連接蛋白(CX43)的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面抗原(CD31、CD34、CD45、CD90)的表達(dá)情況,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測不同時期細(xì)胞膜電位的變化。(2)將純化、擴增后的第4代hMSCs,分3組在體外分別經(jīng)0μmol.l~(-1)、2.5μmol.l~(-1)、5.0μmol.l~(-1) 5-azacytidine(5-Aza)誘導(dǎo)24h后繼續(xù)培養(yǎng)8周,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期及凋亡指數(shù),應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析肌球蛋白重鏈(β-MHC)、肌鈣蛋白T(CTNT)、凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax)的mRNA在分化過程中的動態(tài)表達(dá)。 結(jié)果:hMSCs誘導(dǎo)前為紡錘形,誘導(dǎo)后第2天部分細(xì)胞即開始發(fā)生形變,呈球形或短棒狀,1周后胞漿中顆粒增多,約20～30%細(xì)胞邊緣呈毛刷樣變化;hMSCs表面抗原CD31、CD34、CD45在誘導(dǎo)前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義,CD90未誘導(dǎo)時表達(dá)呈弱陽性,誘導(dǎo)后明顯增高(P0.05);ANP和CX43在誘導(dǎo)前無表達(dá),誘導(dǎo)后第2周開始表達(dá)且表達(dá)隨時間逐漸增強,但CX43在誘導(dǎo)后第5周表達(dá)量開始降低。hMSCs誘導(dǎo)后凋亡指數(shù)隨誘導(dǎo)后培養(yǎng)時間增加,低濃度誘導(dǎo)組低于標(biāo)準(zhǔn)濃度誘導(dǎo)組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),G_0/G_1期細(xì)胞比例誘導(dǎo)后較對照組顯著減少(P0.05);β-MHC和CTNT基因分別在誘導(dǎo)后第1周和第4周時表達(dá)開始增強,在第6周時均達(dá)到高峰,第8周時表達(dá)開始衰減,Bcl-2、Bax基因表達(dá)呈時間依賴性變化,hMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后隨心肌樣細(xì)胞特征的表達(dá)膜靜息電位、去極化幅值和去極化速率逐漸增高。 結(jié)論:(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)純化、擴增和誘導(dǎo)后可表現(xiàn)心肌樣細(xì)胞的生物學(xué)特性,可為hMSCs臨床移植治療提供可靠的細(xì)胞來源;(2)體外誘導(dǎo)過程中hMSCs可發(fā)生細(xì)胞凋亡,采用2.5μmol.l~(-1) 5-Aza低濃度誘導(dǎo)可減少細(xì)胞凋亡發(fā)生;(3)hMSCs移植后有致心律失常的潛在危險。
[Abstract]:Objective: in vitro human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) were purified, amplification and differentiation into cardiomyocyte like cells to cardiomyocytes oriented, characteristic analysis and explore the in vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells induced cell differentiation and apoptosis (hMSCs) to differentiate into cardiomyocytes in the process the situation, to detect the expression changes of muscle cell differentiation characteristics of center and membrane potential, to provide experimental evidence for clinical transplantation in the treatment of hMSCs.
Methods: (1) by in vitro purification, amplification of the fourth generation of hMSCs in vitro by 5 mol.L-1 5- azacytidine induced 24 hours after cultured for 8 weeks, the morphological changes were observed under phase contrast microscope, immunohistochemical method and identification of cardiac specific protein atrial natriuretic peptide (ANP) and protein (CX43 connection) expression by flow cytometry before and after induction of cell surface antigens (CD31, CD34, CD45, CD90) expression, to detect the changes of the whole cell patch clamp technique in different periods of cell membrane potential. (2) the purification, amplification of the fourth generation of hMSCs, divided into 3 groups in vitro respectively by 0 mol.l~ (-1), 2.5 mol.l~ (-1), 5 mol.l~ (-1) 5-azacytidine (5-Aza) induced by 24h after cultured for 8 weeks, the morphological changes were observed under phase contrast microscope, detection of apoptosis rate index by flow cytometry and the application of RT-PCR technology on myosin heavy chain (beta -MHC), troponin T (CTNT),. The dynamic expression of mRNA of Bcl-2 (Bax) in the process of differentiation.
Results: hMSCs before induction of spindle shape, after second days of induction of some cells began to deform, spherical or short rod, after 1 weeks in the cytoplasm of particles increased from about 20 to 30% edge cells were brush like changes; hMSCs surface antigen CD31, CD34, CD45, no statistical significance in the difference of CD90 before and after induction. When not induced expression was weakly positive after induction was significantly increased (P0.05); ANP and CX43 expression in pre induction, and the expression increased gradually with time beginning second weeks after induction of CX43, but in fifth weeks after induction the expression began to decrease.HMSCs after induction of apoptosis index increased with incubation time increased after induction, induced by low concentration group is lower than the standard concentration induced group, there was significant difference between the groups (P0.05), the proportion of cells in G_0/G_1 phase after induction was significantly reduced than the control group (P0.05); beta -MHC and CTNT gene were induced after first weeks and fourth weeks to start in sixth weeks after enhancement At the eighth week, the expression began to decay, and the expression of Bcl-2 and Bax changed in a time-dependent manner. After hMSCs induction, the expression of membrane potential, depolarization amplitude and depolarization rate increased with the induction of cardiomyocyte like cells.
Conclusion: (1) bone marrow mesenchymal stem cells purified by in vitro amplification and biological characteristics of expression after induction of myocardial cells, which can provide a reliable source of cells for clinical transplantation in the treatment of hMSCs; (2) hMSCs in vitro during apoptosis, using 2.5 mol.l~ (-1) 5-Aza of low concentration induction of apoptosis; (3) hMSCs after the transplantation of potentially dangerous arrhythmias.

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329.2

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