本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導分化的實驗研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性的實驗研究。 目的:建立一種簡單,快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并適宜其在體外大量快速增殖的方法;進一步了解骨髓間充質(zhì)干細胞的各種生物學特性。 方法: 1無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨,并用吸取D-Hank’s液的注射器沖出骨髓細胞,置于含10%FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2環(huán)境下進行培養(yǎng),應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進行純化。待細胞達95%融合時,用0.125%的胰酶-0.02%的EDTA消化2-3min后進行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細胞生長特點。2掃描電鏡(SEM)下觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表面的超微結(jié)構(gòu)特征。3 HE染色光鏡觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征。4用MTT法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線,從而進一步了解其生長特性。 結(jié)果:原代培養(yǎng)的骨髓細胞成分復雜,1-2天開始有少量細胞貼壁,形狀不規(guī)則,有長梭形、多角形等。半量換液后,克隆生長的細胞團塊開始迅速增殖,以集落形式生長為主。7-9天左右細胞可長滿培養(yǎng)瓶底,達95%以上融合,主要呈紡錘形,其中散在少量折光性強的小圓形細胞。細胞整體排列更趨于規(guī)律性,呈漩渦狀,輻射狀或魚群樣排列。傳代后的細胞貼壁及生長更加迅速,2h后部分細胞即開始貼壁,24h內(nèi)即可完全貼壁,6-7天可鋪滿培養(yǎng)瓶底。細胞形態(tài)更均一,紡錘形生長,整體呈現(xiàn)漩渦狀,輻射狀或魚群樣排列。傳代10代以上,各代之間細胞生長均一,穩(wěn)定。HE染色示胞體以紡錘形居多,有突起。細胞核大、居中深染,嗜堿性,核仁明顯;胞質(zhì)著色淺,呈弱嗜酸性。P2、P4、P6細胞生長曲線基本相同,分為潛伏期(第1-2天)、對數(shù)生長期(第3-5天)和平臺期(第6-7天),且?guī)状毎g生長狀況穩(wěn)定。掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細胞:以寬大扁平形的細胞為主,長梭形和圓球形細胞占少數(shù)。胞體周圍的突起類似樹枝狀,并互相重疊,相互交織。細胞核大,圓形或橢圓形,核仁1-5個不等。表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起。 結(jié)論:1本部分應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法成功建立了一種體外簡單、快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,并使其在體外迅速得到了增殖,而且性狀穩(wěn)定。2細胞呈均一的紡錘形;P2、P4、P6細胞生長曲線基本相同,細胞增殖快,且?guī)状毎g生長狀況穩(wěn)定。3掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細胞:以寬大扁平形的細胞為主,長梭形和圓球形細胞占少數(shù)。細胞表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起,推測這樣的結(jié)構(gòu)特征可能更有利于細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換。 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外向神經(jīng)元誘導分化的實驗研究 目的:體外定向誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化。 方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,分離、純化、培養(yǎng)、傳代。2分別取不同代數(shù)對數(shù)生長期的細胞,應(yīng)用二甲基亞砜(DMSO)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對其進行不同方式的誘導。應(yīng)用免疫細胞化學染色及western blot的方法鑒定誘導后的細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的表達。 結(jié)果:對照組:細胞在預誘導和正式誘導過程中細胞形態(tài)均無明顯變化,免疫細胞化學結(jié)果顯示NSE為陰性表達。實驗組:細胞在24h的預誘導中形態(tài)無明顯變化,正式誘導后1h細胞胞體開始向胞核收縮,呈圓形;3h后胞體圓形呈典型的核質(zhì)體形態(tài),并開始長出1-3個細胞突起;5h后突起不斷延長,出現(xiàn)2-3級突起并相互交錯;7h后胞體圓形,伸出的2-3級突起相互交織成網(wǎng)狀。其中含血清誘導組中細胞誘導5h開始有部分細胞漂浮死亡現(xiàn)象,而無血清誘導組則無此現(xiàn)象。免疫細胞化學結(jié)果顯示:未行預誘導的兩組中,培養(yǎng)基中有血清組與無血清組的誘導率分別為:71.857±7.08249%、72.597±6.98511%。應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預誘導24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+無血清L-DMEM正式誘導7 h的細胞NSE的表達率為86.67±5.5148%。GFAP和MAP-2在各時間點均表達陰性。western blot結(jié)果顯示誘導后細胞NSE在0h、3h、5h、7h的表達(與β-actin的比值)分別為0.232±0.00364、0.3141±0.00414、0.321±0.00186、0.4683±0.00447。 結(jié)論:1應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預誘導24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+無血清L-DMEM正式誘導7h可以誘導MSC分化成為神經(jīng)元樣細胞,并達到最大的誘導率86.67%。2應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預誘導24h,可顯著提高MSC向神經(jīng)元樣細胞的誘導率。3誘導液中無血清可延長誘導后細胞的生存時間。 三、BrdU體外標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗研究。 目的:探討連續(xù)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用BrdU標記的穩(wěn)定性、最佳階段、時間和劑量,從而達到應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞進行研究最好的示蹤目的。 方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,分離、純化、培養(yǎng)、傳代。2取不同代數(shù)的細胞進行細胞爬片,在細胞生長的不同時期、應(yīng)用不同濃度的BrdU標記不同時間后,用免疫細胞化學染色的方法進行鑒定。 結(jié)果:1對P2、P4、P6的MSC進行BrdU標記,其標記率分別為94.868±3.739%、95.696±3.952%、94.774±3.565%。2對生長至第2、4、6天的細胞進行標記,標記率分別為60.286±6.197%、96.175±3.689%、65.017±5.982%。3對細胞標記24h、48h、72h時,標記率分別為58.895±10.025%、95.375±4.136%、94.835±2.970%。4分別應(yīng)用BrdU濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L標記時,標記率分別為47.192±5.459%、95.382±4.363%、95.993±3.344%。 結(jié)論:1應(yīng)用BrdU對不同代MSC進行標記效果穩(wěn)定。2選擇濃度為10μmol/L,對處于對數(shù)生長期的MSC標記48h,可以達到最大的標記率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1435305