本文關(guān)鍵詞：H5亞型禽流感高產(chǎn)疫苗株構(gòu)建、生物學(xué)特性及其免疫效果的研究　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2006年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 禽流感病毒 反向遺傳學(xué) 重組高產(chǎn)疫苗株 體液免疫 保護(hù)作用

【摘要】：高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza A，HPAI)是由高致病性禽流感病毒中的H5或H7亞型引起的一種禽類的急性、高度接觸性烈性傳染病。自2003年以來，東南亞多個國家暴發(fā)了家禽感染H5N1亞型禽流感疫情，，在6個國家出現(xiàn)人感染禽流感，且死亡率非常高。2005年夏天，HPAI逐漸往西擴(kuò)散，哈薩克斯坦、俄羅斯、羅馬尼亞、土耳其、克羅地亞和烏克蘭暴發(fā)了家禽H5N1亞型HPAI疫情或野生候鳥中出現(xiàn)了H5N1亞型禽流感感染。迄今，H5N1亞型禽流感疫情已在歐洲大陸十幾個國家出現(xiàn)，并蔓延到了非洲。H5N1亞型HPAI不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也對人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。 高致病性禽流感病毒屬于正黏病毒科A型流感病毒，是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。其包膜表面的血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是主要的免疫原性物質(zhì)。大量研究表明，HA在病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中起重要作用。HA也是誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的主要保護(hù)性抗原，抗HA抗體能抑制病毒的血凝活性并能中和病毒，是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的主要保護(hù)性抗體。因此，HA是目前研制流感疫苗的關(guān)鍵成分。 全群捕殺和生物安全防護(hù)是及時撲滅和控制HPAI的主要措施。然而，禽流感疫情大范圍流行時，這些措施可能難以奏效，而疫苗接種可能是一個可靠而經(jīng)濟(jì)的方法。作為疫苗的理想病毒株應(yīng)該是與流行病毒抗原性匹配、致病性低而又能在雞胚中良好生長的毒株。自1996年以來，中國分離的所有H5N1亞型毒株HA裂解位點(diǎn)都有幾個堿性氨基酸殘基，都是高致病性的，因而不適于作為疫苗。采用傳統(tǒng)方法構(gòu)建H5亞型禽流感疫苗株非常困難，而流感病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)為禽流感疫苗的研制提供了新的技術(shù)手段。 本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了H9N2亞型禽源高產(chǎn)病毒株的6個內(nèi)部基因、H5N1亞型高致病性禽流感病毒的血凝素(HA)基因及H2N3亞型參考毒株的神經(jīng)氨酸酶基因。對血凝素HA1和HA2連接處的5個堿性氨基酸殘基(R-R-R-K-K)進(jìn)行基因缺失與修飾，消除了病毒基因的毒力相關(guān)序列。分別構(gòu)建8個基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)載體，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出了全部基因都源于禽的重組禽流感病毒疫苗株rH5N3。rH5N3疫苗株對雞和雞胚均無致病性，在雞胚尿囊液的HA效價極大提高，是其親本H5N1毒株的8倍。該禽流感疫苗免疫雞后2周即可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的HI抗體，免疫后18周依然保持高水平的HI抗體，不論是對于國內(nèi)早期分離的禽流感病毒強(qiáng)毒株A／Goose／Guangdong／1／96還是近期分離的強(qiáng)毒株A／Goose／HLJ／QFY／04都能夠產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)作用。 一、H5亞型禽流感高產(chǎn)疫苗株的構(gòu)建 采用RT-PCR技術(shù)，從鵝源高產(chǎn)禽流感病毒A／Goose／Dalian／3／01(H9N2)擴(kuò)增6條內(nèi)部基因片段，從高致病性禽流感病毒A／Goose／HLJ／QFY／04(H5N1)擴(kuò)增HA基因片段，從禽流感參考株A／Duck／Germany／1215／73(H2N3)擴(kuò)增NA基因片段。將其分別與質(zhì)粒pHW2000連接，獲得含8個目的基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA的重組質(zhì)粒pML-PB2、pML-PB1、pML-PA、pML-NP、pML-M、pML-NS、pML-HA和pML-NA。其中HA基因已按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)刪除了與毒力相關(guān)的連續(xù)5個堿性氨基酸殘基(R-R-R-K-K)。將8個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T／MDCK混合細(xì)胞單層，72h后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清獲得重組禽流感病毒，其血凝效價為1：32。結(jié)果表明，我們已構(gòu)建成功重組禽流感疫苗株，命名為rH5N3。 二、重組禽流感疫苗株rH5N3的生物學(xué)特性 (一)抗原性分析 以血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制(neuraminidase inhibition，NI)試驗(yàn)分析重組病毒rH5N3的抗原性，發(fā)現(xiàn)其血凝活性可為雞抗A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)和A／Goose／HLJ／QFY／04(H5N1)抗血清完全抑制，HI效價分別為1：512和1：1024，但是不能夠被抗親本毒株A／Goose／Dalian／01(H9N2)抗血清抑制；抗參考毒株A／Duck／Germany／1215／73(H2N3)抗血清對rH5N3的NI效價為1：800，抗A／Goose／HLJ／QFY／2004抗血清對rH5N3的NI效價小于1：10。結(jié)果表明，rH5N3毒株具有符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的H5和N3亞型基因表型。 (二)致病性分析 用10~(-1)～10~(-10)稀釋的重組株rH5N3接種SPF雞胚(0.1ml／枚)，37℃孵化48h，收集尿囊液測血凝(hemagglutination，HA)活性，按Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)感染劑量(EID_(50))為2×10~9／mL；以1×10~8 EID_(50)劑量rH5N3接種雞胚，培養(yǎng)96h雞胚仍然存活。將1：10稀釋的重組毒株rH5N3尿囊液靜脈接種4周齡SPF雞(0.1ml／只)，每日觀察雞的臨床表現(xiàn)，分別計(jì)算靜脈接種致病指數(shù)(intravenous pathogenicity index，IVPI)，發(fā)現(xiàn)10天觀察期內(nèi)感染雞無任何異�；蚺R床發(fā)病，IVPI指數(shù)等于0。結(jié)果表明，重組病毒rH5N3對雞胚無致死性，對于雞屬于低致病性毒株。 (三)生長特性分析 將1：10稀釋的rH5N3及其親本毒株A／Goose／HLJ／QFY／04尿囊液各0.1ml分別接種MDCK細(xì)胞單層，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，血凝試驗(yàn)測定rH5N3、A／Goose／HLJ／QFY／04培養(yǎng)上清液的血凝效價分別為1：512和1：64。經(jīng)絨毛尿囊腔途徑分別接種10日齡SPF雞胚，0.1mL／枚，置37℃恒溫箱中孵育，無菌收集48h尿囊液，rH5N3和A／Goose／HLJ／QFY／04尿囊液血凝價分別為1：2048和1：256。表明重組病毒rH5N3哺乳細(xì)胞系和雞胚中生長良好，為一株高產(chǎn)禽流感疫苗株。 (四)遺傳穩(wěn)定性分析 將1：10稀釋的rH5N3尿囊液0.1ml接種10日齡SPF雞胚，置37℃恒溫箱中孵育48h，收集尿囊液繼續(xù)傳代，連續(xù)雞胚傳10代。對第10代rH5N3病毒進(jìn)行核酸序列測定，發(fā)現(xiàn)其與rH5N3親本毒株核酸序列相同，證明該疫苗株具有很好的遺傳穩(wěn)定性。 三、重組禽流感疫苗株rH5N3的免疫效果 (一)免疫效力 6周齡SPF雞隨機(jī)分為不同疫苗劑量(0.1、0.3、0.6、0.9 mL／只)組和對照組(0.6 mL PBS／只)，每組8只。重組病毒rH5N3經(jīng)甲醛滅活后按礦物油：含毒尿囊液1：2比例制成油包水型油乳劑滅活疫苗，給SPF雞頸部皮下注射，免疫后不同時間采血，測定其HI抗體滴度，計(jì)算抗體效價的幾何均數(shù)。免疫后7天個別雞出現(xiàn)低效價HI抗體；免疫后2周所有雞都產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答，即使0.1mL低劑量免疫組HI抗體效價也可達(dá)到1：128(7 log2)以上；免疫后4周HI抗體水平達(dá)到高峰，HI抗體效價可達(dá)1：256(8 log2)以上；免疫后18周HI抗體幾何均數(shù)仍然大于1：16這一抗體保護(hù)臨界值。表明rH5N3具有良好的免疫原性。 (二)保護(hù)作用 3周齡SPF雞免疫前采血測HI抗體全部陰性。rH5N3滅活疫苗經(jīng)雞頸部皮下接種，免疫后3周采血測定HI抗體滴度，同時采用滴鼻、點(diǎn)眼方式進(jìn)行H5N1亞型強(qiáng)毒株(A／Goose／Guangdong／1／96和A／Goose／HLJ／QFY／04)攻擊。攻毒后的第3和第7天分別采取咽喉和泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離與滴定，攻毒后14天采血測定攻毒后存活雞的HI抗體水平。發(fā)現(xiàn)0.3 mL疫苗即能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的HI抗體，幾何均數(shù)在1：512(9 log2)以上。100 CLD_(50) HPAIV攻擊，rH5N3疫苗免疫雞無臨床發(fā)病或死亡，病毒分離全部陰性。對照組雞在攻毒后2～5天全部死亡，病毒分離均為陽性。結(jié)果表明，rH5N3疫苗免疫不但能夠保護(hù)雞抵抗HPAI病毒的致死性攻擊，也能夠起到減少或防止病毒在雞群中的傳播的作用。 本研究選擇2004年國內(nèi)流行的H5N1亞型HPAIV代表株作為疫苗株HA基因供體，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出全部基因片段都來自禽源的重組禽流感疫苗株rH5N3。由于刪除HA基因中與毒力相關(guān)的5個連續(xù)堿性氨基酸，而使疫苗株對雞和雞胚的毒力完全消除；選取國內(nèi)流感病毒中較少見的神經(jīng)氨酸酶亞型N3作為疫苗株的分子標(biāo)記，為疫苗免疫家禽和野毒感染家禽的鑒別診斷提供方便；rH5N3疫苗株具有安全、低毒的特性，與野毒株相比不僅抗原性完全一致，而且雞胚生長性能大大改善；基因重組疫苗株不僅具有很好的遺傳穩(wěn)定性，而且具有良好的免疫原性，免疫動物完全能夠抵抗強(qiáng)毒株的致死性攻擊。該疫苗株的成功研制為H5N1亞型HPAI的防控提供了新的技術(shù)保障。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 焦鳳超;焦新安;潘志明;黃金林;張小榮;劉秀梵;;減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的H5亞型禽流感病毒DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)免疫效果研究[J];病毒學(xué)報;2006年01期

2 劉紅旗,劉秀梵,張如寬;A型流感病毒蛋白研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2002年02期

3 黃庚明,辛朝安;禽流感病毒血凝素(HA)基因的研究進(jìn)展[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2001年02期

4 童光志,付朝陽;禽流感的現(xiàn)實(shí)危害與潛在威脅[J];科技導(dǎo)報;2004年04期

5 A.A.Quresh ,李增光;禽流感的疫苗接種[J];中國禽業(yè)導(dǎo)刊;2002年08期

6 仇華吉,李衛(wèi)平,童光志;RNA復(fù)制子疫苗[J];中國生物工程雜志;2003年03期

7 王靖飛,童光志;禽流感:一種人畜共患病[J];生物技術(shù)通報;2004年04期

8 程堅(jiān),劉秀梵,彭大新,劉紅旗;表達(dá)H9亞型禽流感病毒血凝素基因的重組雞痘病毒及其免疫效力[J];微生物學(xué)報;2002年04期

9 盧建紅,龍進(jìn)學(xué),邵衛(wèi)星,韋棟平,劉秀梵,張艷梅;用反向遺傳操作技術(shù)產(chǎn)生致弱的H5亞型重組流感病毒[J];微生物學(xué)報;2005年01期

10 唐秀英,田國斌,于康震,馮菊艷;禽流感油乳劑滅活疫苗的研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;1999年06期

本文編號：1426986