本文關(guān)鍵詞：小鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)基因研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2006年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：圓錐動(dòng)脈干是在心臟胚胎發(fā)育時(shí)期連接動(dòng)脈弓的動(dòng)脈干和連接心室的圓錐部的總稱。心臟圓錐動(dòng)脈干缺損是圓錐動(dòng)脈干發(fā)育障礙所造成的一類先天性心臟病，包括法洛四聯(lián)癥、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動(dòng)脈干等多種導(dǎo)致紫紺和低氧血癥的心臟復(fù)雜畸形，這類復(fù)雜心血管畸形約占先天性心臟病的30％。人類CTD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但近二十年來的研究發(fā)現(xiàn)提示，Connexin 43(Cx43)基因及心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞與心臟錐干部發(fā)育密切相關(guān)。心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞是從枕部神經(jīng)嵴分化出來的一群細(xì)胞，這群細(xì)胞通過第3，4，6咽弓向原始心管遷移，最后停留在動(dòng)脈干和動(dòng)脈圓錐等部位分化為間充質(zhì)細(xì)胞，主要參與心臟流出道隔及大血管的形成。研究發(fā)現(xiàn)，如果在遷移之前切除散發(fā)到第3、4、6咽弓的神經(jīng)嵴細(xì)胞，就會(huì)出現(xiàn)永存動(dòng)脈干、主動(dòng)脈騎跨、右室雙出口、主動(dòng)脈弓畸型和室間隔缺損等心血管畸形，且切除的長度與畸形的種類相關(guān)，如切除長度大于兩個(gè)體節(jié)可產(chǎn)生永存動(dòng)脈干，切除長度小于兩個(gè)體節(jié)則產(chǎn)生右室雙流出道，由此可見，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞對于心臟圓錐部的發(fā)育意義重大。Cx43是細(xì)胞縫隙連接基因家族的成員之一，近年的研究發(fā)現(xiàn)其與心血管發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43基因剔除小鼠、過量表達(dá)Cx43的CMV43轉(zhuǎn)基因小鼠和顯性失活抑制Cx43組成的細(xì)胞間隙的信息交流的FC轉(zhuǎn)基因小鼠均可見右室流出道畸形和梗阻，從而說明，精確的Cx43基因表達(dá)對于圓錐部的發(fā)育至關(guān)重要。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，Cx43大量表達(dá)于遷移性神經(jīng)嵴細(xì)胞之上(最早于ED9.5d即可見)，并參與形成心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的縫隙連接。越來越多的研究提示Cx43可能通過調(diào)節(jié)心臟神經(jīng)嵴的行為而間接影響心臟的形態(tài)發(fā)生。因此，本課題利用Cx43基因剔除(knockout，KO)小鼠模型結(jié)合日益發(fā)展的基因芯片技術(shù)進(jìn)行研究，旨在研究Cx43基因?qū)π呐K神經(jīng)嵴的誘導(dǎo)、發(fā)生、分離、遷移、分化的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步闡明Cx43影響心臟圓錐發(fā)育過程其可能的分子機(jī)制。 第一部分 小鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的體外培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究 研究目的 體外培養(yǎng)和鑒定心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞，并探討其增殖、遷移及分化等生物學(xué)特性。 材料與方法 成年2月齡C57／BL6小鼠交配，取ED8.5d小鼠胚胎枕中部至第3體節(jié)神經(jīng)管，應(yīng)用包含堿性纖維生長因子(bEGF)和表皮細(xì)胞生長因子(EGF)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，采用轉(zhuǎn)錄激活因子2α(AP-2α，Activator protein-2α)作為其生物學(xué)標(biāo)記物，觀察其增殖狀況、細(xì)胞周期、遷移、分化等生物學(xué)特性。 結(jié)果 從胎鼠神經(jīng)管中分離培養(yǎng)的細(xì)胞增殖旺盛，AP-2α表達(dá)陽性，細(xì)胞具有明顯遷移特性，傳代后以含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后能誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 小結(jié) 1．采用無血清培養(yǎng)技術(shù)在體外培養(yǎng)可成功獲得心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞； 2．體外培養(yǎng)的心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖旺盛，具有遷移特性和多向潛能分化能力 第二部分 Cx43基因敲除鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的基因表達(dá)及驗(yàn)證 研究目的 研究Cx43基因敲除(Cx43 KO)小鼠胚胎心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞中基因表達(dá)譜的改變，篩選可能導(dǎo)致Cx43KO小鼠圓錐動(dòng)脈干畸形的相關(guān)基因，，并探討相關(guān)機(jī)制。 材料與方法 以胎齡(embryonic day，ED)8.5天的Cx43KO和野生型(Cx43WT)鼠胚心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞為研究對象，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；并在體外轉(zhuǎn)錄為cRNA，同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記及片段化；再與Affymetrix-430 2.0基因芯片進(jìn)行雜交。雜交信號經(jīng)掃描后，應(yīng)用相關(guān)生物信息軟件分析基因表達(dá)情況。選取部分差異基因應(yīng)用RT-PCR方法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可靠性。 結(jié)果 1、與WT組相比，Cx43KO組中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有288個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有124個(gè)。這些差異基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期及代謝等多種功能，其中與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因數(shù)改變最多。 2、PT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果相符，Affymetrix基因芯片結(jié)果能夠很好的反映Cx43敲除鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞與野生型鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的差異基因表達(dá)。 小結(jié) 利用基因芯片技術(shù)初步篩選出Cx43KO鼠心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞中多個(gè)差異基因，這些差異基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期及代謝等多種功能，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因數(shù)改變最多，提示Cx43可能主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑影響心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)、發(fā)生、分離、遷移等生物學(xué)功能并最終影響心臟圓錐部的發(fā)育。
[Abstract]:Conotruncus is in general heart during embryonic development of arterial arch artery connection and connection ventricle conus. A kind of congenital heart disease is a defect of conotruncal development disorder caused by the conotruncal heart, including tetralogy of Fallot, transposition of the great arteries, double outlet of right ventricle, truncus artery etc. leading to cyanosis and hypoxemia in complex heart malformations, the pathogenesis of complex cardiovascular malformations of congenital heart disease 30%. human CTD complex, but nearly twenty years of research found that Connexin 43 (Cx43) gene and cardiac neural crest cells closely related to conotruncal development. Cardiac neural crest cells is a group of cells from the occipital neural crest differentiation, these cells through the 3,4,6 pharyngeal arch to original heart tube migration, the last stop in the differentiation of artery and conotruncal region for mesenchymal cells, mainly Participate in the formation of cardiac outflow tract septum and blood vessel. The study found that if the neural crest cells before migrating to 3,4,6 with resection of the pharyngeal arch, there will be persistent truncus arteriosus, aorta, double outlet right ventricle, aortic arch cardiovascular ventricular septal defect and deformity, and resection length associated with the type of deformity, such as the removal of length greater than two somites can produce persistent truncus arteriosus, resection length less than two segments had double outlet of right ventricle, thus, cardiac neural crest cells is a member of the cell gap junction gene family for the development of heart in conus major.Cx43, recent studies have found that they are closely related and cardiovascular development. The study found that Cx43 gene knockout mice, FC transgenic mice can exchange information over expression of intercellular Cx43 CMV43 transgenic mice and dominant inhibition of Cx43 composed of the See the right ventricular outflow tract malformation and obstruction, and that the Cx43 gene is essential for the accurate expression of conotruncal development. During mouse embryonic development, Cx43 expression on migration of neural crest cells (the earliest in ED9.5d is visible, and participate in the formation of cracks) of CNCCs connection. More and more research suggested that Cx43 may regulate the cardiac neural crest behavior indirectly affect cardiac morphogenesis. Therefore, the issue of the use of Cx43 (knockout, KO) gene knockout mouse model with gene chip technology development of the research is to study Cx43 gene induction on cardiac neural crest, separation, transfer, regulation mechanism differentiation, further clarify the development process of Cx43 heart cone affect its possible molecular mechanism.
In vitro culture and biological characteristics of cardiac neural crest cells in part 1 of mice
research objective
In vitro culture and identification of cardiac neural crest cells, and their biological characteristics, such as proliferation, migration and differentiation, are discussed.
Materials and methods
Adult C57 / BL6 mice mating age of February, from ED8.5d to third middle occipital somite mouse embryonic neural tube, including application of basic fibroblast growth factor (bEGF) and epidermal growth factor (EGF) in serum-free culture medium, detection of cell proliferation by MTT assay, the cell cycle was analyzed by flow cytometry, the transcription the activation of factor 2 alpha (AP-2 alpha, alpha Activator protein-2) as the biological marker to observe the proliferation, cell cycle, migration, differentiation and other biological characteristics.
Result
The proliferation and proliferation of cells from fetal rat neural tube were strong. The expression of AP-2 alpha was positive, and the cells had obvious migration characteristics. After passage, cultured in serum containing medium, they could be induced to differentiate into neurons and glial cells.
Summary
1. the heart neural crest cells can be successfully obtained by serum-free culture in vitro.
2. in vitro cultured cardiac neural crest cells proliferate vigorously, and have the ability of migration and multipotential differentiation.
Gene expression and verification of the second part of Cx43 gene knockout rat heart neural crest cells
research objective
Objective to study the changes of gene expression profiles in embryonic cardiac neural crest cells of Cx43 knockout (Cx43 KO) mice, and screen related genes that may cause cones arteriosus malformation in Cx43KO mice, and explore the related mechanisms.
Materials and methods
For gestational age (embryonic day, ED) 8.5 days Cx43KO and wild type (Cx43WT) of rat embryonic cardiac neural crest cells as the object of study, total RNA was extracted, reverse transcribed into cDNA; and in vitro transcribed into cRNA, and biotin labeling and fragmentation; and Affymetrix-430 2 gene chip hybridization. By scanning the hybridization signal, analysis of gene expression related to application of bioinformatics software. The reliability of selected genes using RT-PCR method to verify the results of gene chip.
Result
1, compared with the WT group, Cx43KO group, expression of 2 times more than 288 genes were downregulated, 2 times more than 124 genes. These genes were mainly involved in transcriptional regulation, cell movement, cell cycle and metabolism function, and transcriptional regulation of genes related to the change in the number of the most.
2, the PT-PCR results were consistent with the results of gene chip. Affymetrix microarray results could well reflect the differential gene expression between cardiac Cx43 and knockout rat cardiac neural crest cells.
Summary
Using the gene chip technology was screened multiple gene differences in Cx43KO rat cardiac neural crest cells, these genes were mainly involved in regulation of transcription, cell movement, cell cycle and metabolism of a variety of functions, including transcriptional regulation of genes related to change the number of the most, suggesting that Cx43 may be mainly through transcriptional regulation pathways induced cardiac neural crest cells the occurrence of separation, migration and other biological functions and ultimately affect cardiac conotruncal development.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R725.4;R329

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本文編號：1415490