本文關鍵詞：基于免疫親合分離技術的人血漿蛋白質(zhì)組研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2006年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：人血液含有來源于幾乎所有細胞、組織、器官的蛋白質(zhì)，可以直接反映病理、生理狀態(tài)，是各種疾病診斷、生物標志物發(fā)現(xiàn)的最有價值的標本。因此，血漿蛋白質(zhì)組成為人們研究的熱點。而血漿蛋白質(zhì)又具有獨特的性質(zhì)(蛋白質(zhì)組成、功能及結(jié)構形式極端復雜)，高低豐度蛋白質(zhì)含量的動態(tài)范圍可差10~(12)之巨，限制了質(zhì)譜對低豐度蛋白的有效檢測，對血漿蛋白質(zhì)組學的研究技術體系提出了挑戰(zhàn)。因此，如何去除血漿中高豐度蛋白質(zhì)從而使低豐度蛋白質(zhì)得以富集(降低高豐度蛋白質(zhì)對低豐度蛋白質(zhì)鑒定的干擾)，成為血漿蛋白質(zhì)鑒定的關鍵和研究熱點。目前基于免疫親合去除血漿高豐度蛋白質(zhì)的技術得到研究者普遍認可和廣泛的應用，但由于血漿中幾種高豐度蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)或結(jié)合蛋白，高豐度蛋白質(zhì)的去除可能會造成其他蛋白質(zhì)的損失，這是血漿蛋白質(zhì)組表達譜和差異蛋白質(zhì)組研究者普遍關注的問題，，也是本課題研究的主要內(nèi)容；另外，對免疫親合系統(tǒng)處理樣本時造成蛋白質(zhì)非特異丟失的原因進行了考察與分析；基于兩種免疫親合分離(而非免疫親合去除)技術的血漿蛋白質(zhì)組研究，使更大范圍的血漿蛋白質(zhì)鑒定得以實現(xiàn)，為今后大規(guī)模血漿蛋白質(zhì)組研究提供新的思路。 在本研究中，我們用目前廣泛應用的可同時去除六種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合色譜柱(Agilent MARS)和剛剛發(fā)展的同時去除十二種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合色譜柱(Genway SepproTM MIXED12)分離人血漿樣本，分別得到與親合柱結(jié)合的組分(MARS-BF和SepproTM-BF)和流出組分(MARS-FF和SepproTM-FF)。這四個蛋白質(zhì)組分別經(jīng)胰蛋白酶酶切后得到復雜肽混合物，采取離線陽離子交換色譜分離及反相色譜離子阱串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的技術體系，分別對肽混合物進行分離鑒定。采用國際人類蛋白質(zhì)組組織血漿蛋白質(zhì)組項目(HUPO PPP)推薦的過濾參數(shù)，共鑒定蛋白質(zhì)2401種，屬于較大的血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集。當采用更嚴格的過濾參數(shù)，四個組分共鑒定蛋白質(zhì)529種，其中277種蛋白質(zhì)是HUPO PPP鑒定的889種中沒有覆蓋的。鑒定蛋白質(zhì)的動態(tài)范圍為9個數(shù)量級(albumin，35mg／mL-Angiotensinogen precursor，＜10pg／mL)。采用搜索反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫的方法評價數(shù)據(jù)可靠性，結(jié)果表明肽段鑒定的可靠性從73.6％上升到99％。為了確定結(jié)合組分中大量的非靶蛋白質(zhì)的存在是否是由于其和高豐度蛋白質(zhì)的相互作用造成的，我們對白蛋白做了免疫共沉淀實驗，并對其結(jié)合蛋白質(zhì)進行了質(zhì)譜
[Abstract]:People with blood from almost all cells, tissues, organs of the protein, can directly reflect the pathological and physiological state, is a variety of disease diagnosis, biomarker discovery of the specimens. Therefore, plasma protein composition is the focus of the research. The plasma protein has unique properties (proteins. The function and structure of the complex dynamic range), extreme abundance protein content difference of 10~ (12) of the giant, limits the effective detection of low abundance protein mass spectrometry, it is a challenge to the technical system of plasma proteomics. Therefore, how to remove high abundance proteins in plasma and enrich the low abundant proteins (to reduce the interference of high abundance proteins of low abundance protein identification), is a key and hot research of plasma protein identification. At present based on immunoaffinity removal of high abundance plasma proteins The researchers generally accepted and widely used, but because of some high abundance proteins in plasma is a transporter protein or binding protein, high abundance protein removal may cause the loss of other proteins, the plasma proteome expression and proteome research issues of common concern, but also the main contents of this research in addition, the; of immunoaffinity sample processing system when the cause of protein loss were studied; two based on immunoaffinity separation (not immunoaffinity removal) plasma proteomic techniques, so that a wider range of plasma protein identification can be realized, for future large-scale plasma proteomics the research provides new ideas.
In this study, we applied the current widely used can simultaneously remove immune six high abundance protein affinity chromatography column (Agilent MARS) and immune development just get rid of twelve high abundance protein affinity chromatography column (Genway SepproTM MIXED12) isolated from human plasma samples obtained with affinity column combination group respectively (MARS-BF and SepproTM-BF) and outflow components (MARS-FF and SepproTM-FF). These four proteins were digested by trypsin complex peptide mixtures, technology system taken offline cation exchange chromatography separation and reversed-phase chromatography ion trap tandem mass spectrometry identification, isolation and identification of peptide mixtures were used. The International Human Proteome Organization plasma proteome project (HUPO PPP) criteria, 2401 proteins were identified, belonging to the plasma proteome. When using larger data sets more stringent The filter parameters, four components were identified 529 proteins, 277 proteins which is HUPO PPP identification is not covered in 889. The dynamic range of the protein is 9 orders of magnitude (albumin, 35mg / mL-Angiotensinogen < precursor, 10pg / mL). The database search inversion method to evaluate the reliability of data and the results show that the reliability of peptides increased from 73.6% to 99%. in order to determine the binding of non target protein components in the presence of a large number of whether it is the result of its interaction with high abundance proteins, we do albumin co immunoprecipitation experiments, and the combination of protein mass spectrometry

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R341

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本文編號：1413131