本文關(guān)鍵詞：Daxx介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與膽固醇蓄積的關(guān)系　出處：《南華大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Daxx 氧化型低密度脂蛋白 巨噬細(xì)胞 凋亡 caveolin-1 siRNA

【摘要】： 目的：研究Daxx介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與膽固醇蓄積的關(guān)系。 方法：用不同濃度的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)處理RAW264.7細(xì)胞48h，MTT法檢測(cè)ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)和DNA斷裂片段分析法研究ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；用特異性siRNA沉默Daxx在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)AO／EB染色觀察基因沉默后的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變；高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況；Real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Daxx mRNA、SCAP mRNA的表達(dá)情況；用Western Blot印跡法檢測(cè)caveolin-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)不同濃度ox-LDL(0 mg／L、12.5 mg／L、25 mg／L、50 mg／L、75 mg／L)處理RAW264.7細(xì)胞48h后，MTT結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活性明顯下降，依次為100％±7.28％；103.2％±16.35％；76.27％±16.54％；56.49％±11.94％；40.65％±8.76％，ox-LDL在25mg／L時(shí)就對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯的抑制作用，IC_(50)=50.6mg／L。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為2.3％，用12.5 mg／L、25 mg／L、50 mg／L、75 mg／L ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞48h，凋亡率分別為4.9％、8.6％、14.7％、33.1％，凋亡率呈明顯的濃度依賴性變化。此外，50 mg／L ox-LDL處理細(xì)胞不同時(shí)間(0h、12h、24h、48h、72h)，隨著ox-LDL作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間依賴性增加，50mg／L ox-LDL處理72h組凋亡率為27.9％。同時(shí)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析DNA斷片，50mg／L ox-LDL處理細(xì)胞48h組可觀察到凋亡特征性DNA梯形條帶。Real time RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ox-LDL濃度的遞增和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Daxx mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性增加。在50 mg／L ox-LDL處理細(xì)胞48h時(shí)Daxx mRNA的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高(Daxx／β-actin mRNA由1.25×10~(-4)上升至5.3×10~(-4))。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)50mg／L ox-LDL處理48h后，AO／EB染色顯示明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，出現(xiàn)核固縮、碎裂，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量顯著增加(由76.3μg／mg蛋白上升至368.5μg／mg蛋白)，油紅O顯示細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴存在。用特異性siRNA沉默Daxx在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)能引起凋亡抑制，AO／EB染色顯示細(xì)胞凋亡率明顯降低，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯下降(由368.5μg／mg蛋白下降至236.9μg／mg蛋白)，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴也明顯減少；Western-blot顯示caveolin-1表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)，轉(zhuǎn)染Daxx siRNA后其表達(dá)有所下調(diào)；Real time RT-PCR結(jié)果表明ox-LDL抑制SCAP mRNA的表達(dá)，經(jīng)RNA干擾后，SCAP mRNA的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：1、Daxx具有介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡作用。 2、Daxx可能通過(guò)下調(diào)SCAP的表達(dá)和上調(diào)caveolin-1的表達(dá)來(lái)影響巨噬細(xì)胞源性荷脂細(xì)胞膽固醇的攝取，從而發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。
[Abstract]:Aim: to study the relationship between Daxx-mediated ox-LDL-induced macrophage apoptosis and cholesterol accumulation. Methods: RAW264.7 cells were treated with oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) for 48 h. The effect of ox-LDL on the growth of RAW264.7 cells was detected by MTT assay. Flow cytometry and DNA fragment analysis were used to study the apoptosis induced by ox-LDL. The expression of Daxx in RAW264.7 cells was silenced by specific siRNA. The morphological changes of apoptosis after gene silencing were observed by AO/EB staining. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the content of cholesterol in the cells. The formation of lipid droplets was observed by oil red O staining. The expression of Daxx mRNA-SCAP mRNA was detected by Real time RT-PCR. The expression of caveolin-1 protein was detected by Western Blot blot. Results: after different concentrations of ox-LDL(0 mg / L ~ (12.5) mg / L ~ (25) mg / L ~ (50) mg/L. RAW264.7 cells were treated with 75 mg / L for 48 h. The results showed that with the increase of drug concentration, the cell activity decreased significantly (100% 鹵7.28). 103.2% 鹵16.35; 76.27% 鹵16.54; 56.49% 鹵11.94; At 25 mg / L, 40.65% 鹵8.76% ox-LDL significantly inhibited cell activity. The results of flow cytometry showed that the apoptotic rate of the control group was 2.3, with 12.5 mg / L ~ (25 mg / L) of 25 mg / L ~ (50) mg/L. When 75 mg/L ox-LDL was treated with RAW264.7 cells for 48 h, the apoptotic rate was 4.9% and 8.6%, respectively. The apoptosis rate was in a dose-dependent manner. In addition, the cells were treated with 50 mg/L ox-LDL for 12 h, 24 h, 48 h and 72 h). With the prolongation of ox-LDL, the apoptosis rate increased in a time-dependent manner. The apoptotic rate of 50 mg / L ox-LDL treated for 72 h was 27.9.The DNA fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis. Apoptosis characteristic DNA trapezoid band. Real time was observed in cells treated with 50 mg / L ox-LDL for 48 h. The results of RT-PCR showed that with the increase of ox-LDL concentration and the prolongation of action time. The relative expression of Daxx mRNA was increased in a concentration-and time-dependent manner. Daxx was treated with 50 mg/L ox-LDL for 48 h. The relative expression of mRNA is the highest (. Daxx / 尾 -actin mRNA increased from 1.25 脳 10 ~ (-4) to 5.3 脳 10 ~ (-4)). RAW264.7 cells were treated with 50 mg / L ox-LDL for 48 h. AO/EB staining showed obvious morphological characteristics of apoptosis, nuclear pyknosis and fragmentation. At the same time, the content of cholesterol increased significantly (from 76.3 渭 g / mg protein to 368.5 渭 g / mg protein). Oil red O showed a large number of lipid droplets in the cells. Silencing the expression of Daxx in RAW264.7 cells with specific siRNA could induce apoptosis inhibition. AO/EB staining showed that the apoptosis rate and cholesterol content were significantly decreased (from 368.5 渭 g / mg protein to 236.9 渭 g / mg protein). Oil red O staining showed that lipid droplets also decreased significantly. Western-blot showed that the expression of caveolin-1 was up-regulated in a time-dependent manner, and its expression was down-regulated after transfection of Daxx siRNA. The results of Real time RT-PCR showed that ox-LDL inhibited the expression of SCAP mRNA and up-regulated the expression of SCAP mRNA after RNA interference. Conclusion Daxx can mediate the apoptosis of RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL. 2Daxx may affect cholesterol uptake of macrophage derived lipids by down-regulating the expression of SCAP and up-regulating the expression of caveolin-1, thus promoting apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1386899