本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒正鏈負(fù)性調(diào)節(jié)元件的鑒定與功能研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染人體后將導(dǎo)致急、慢性乙型肝炎,部分患者演變?yōu)楦斡不?甚至肝細(xì)胞癌,是一種嚴(yán)重危害人類健康的病原體。目前,抗HBV感染的治療效果遠(yuǎn)不能令人滿意,其重要原因之一就是不能快速有效地抑制HBV的復(fù)制表達(dá)和清除病毒。 HBV在感染肝細(xì)胞胞核內(nèi)持續(xù)復(fù)制,難以被抗病毒藥物徹底清除。HBV在肝細(xì)胞中強(qiáng)大的復(fù)制能力說明病毒擁有一套嚴(yán)密精確的自我調(diào)控機(jī)制,使病毒持續(xù)復(fù)制增殖,在體內(nèi)建立持久的感染。因此,尋找HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件,不僅有利于深入了解病毒的分子生物學(xué)特性,而且對(duì)于開發(fā)研制針對(duì)新的抗HBV靶位的藥物也具有重要意義。 作為調(diào)控元件的一段DNA序列,可與某些細(xì)胞蛋白或病毒蛋白結(jié)合,正性或負(fù)性在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前,人們對(duì)于HBV負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究已較透徹,而對(duì)HBV正鏈(即反義鏈)的轉(zhuǎn)錄及調(diào)節(jié)卻知之甚少。目前的研究結(jié)果表明,HBV正鏈產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄體(antisense RNA,asRNA)在細(xì)胞系或體內(nèi)含量很低,對(duì)病毒的復(fù)制及表達(dá)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用,而HBV在演變過程中也采取了一些“策略”抑制由正鏈轉(zhuǎn)錄的asRNA的產(chǎn)生,例如通過HBV正鏈上的負(fù)性調(diào)節(jié)元件下調(diào)正鏈的轉(zhuǎn)錄。 本課題主要利用熒光素酶檢測體系,通過PCR掃描,缺失突變和實(shí)時(shí)定量PCR等方法,對(duì)HBV正鏈基因組進(jìn)行全面的解析,力圖發(fā)現(xiàn)在HBV正鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用的新的調(diào)控元件,特別是抑制性元件,并對(duì)其進(jìn)行較為精確的定位,分析其作用方式及機(jī)理,為深入理解HBV復(fù)制表達(dá)的自身調(diào)控提供新的知識(shí),為抗HBV感染的治療提供新的思路。研究結(jié)果表明,HBV正鏈nt509-1(3182)-2639序列在肝源性細(xì)胞(HepG2)中能下調(diào)熒光素酶(luciferase)活性,降低luciferase mRNA水平,由此推測,HBV正鏈nt509-1(3182)-2639序列中含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件,能抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄。通過一系列的缺失突變分析,負(fù)性調(diào)節(jié)元件的范圍被確定為HBV正鏈nt453-250序列。對(duì)這一負(fù)性調(diào)節(jié)元件作用方式的研究結(jié)果表明,負(fù)性調(diào)節(jié)作用是不依賴于其插入方向及插入位點(diǎn)的,不管是以luciferase還是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因,當(dāng)這段序列以nt453-250或者nt250-453的方向分別插入目的基因啟動(dòng)子的上游或者polyA之后時(shí),均觀察到對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出明顯的抑制作用。而不同的啟動(dòng)子(SV40,CMV)也不影響HBV nt453-250序列負(fù)性調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮。對(duì)負(fù)性調(diào)節(jié)元件嗜肝性的研究結(jié)果表明,HBV nt453-250序列在非肝源性細(xì)胞A549(肺癌細(xì)胞系)和Hela(宮頸癌細(xì)胞系)中也能下調(diào)目的基因的表達(dá),因此,這種負(fù)性調(diào)節(jié)作用無肝臟特異性,與HBV的嗜肝性無關(guān)。對(duì)負(fù)性調(diào)節(jié)元件轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究結(jié)果表明,HBV nt453-250序列對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始階段,而非延伸階段或者轉(zhuǎn)錄后水平。定點(diǎn)突變的研究結(jié)果表明,HBV nt453-250序列由三個(gè)亞元件組成,分別為HBVnt453-434,HBVnt403-384,HBVnt283-264片段,以協(xié)同的方式發(fā)揮抑制作用。同源性分析的結(jié)果表明,HBV nt453-250負(fù)性調(diào)節(jié)元件及三個(gè)亞元件在HBV各基因型和嗜肝DNA病毒科的其他病毒(WHV, DHBV)中均有較高的同源性。 本課題的研究結(jié)果表明HBV nt453-250序列是HBV正鏈上一個(gè)新的負(fù)性調(diào)節(jié)元件,至今未見國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道。HBV正鏈上的負(fù)性調(diào)節(jié)元件,通過下調(diào)HBV asRNA的表達(dá),促進(jìn)HBV以負(fù)鏈為模板轉(zhuǎn)錄,保護(hù)負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為逆轉(zhuǎn)錄及翻譯相應(yīng)病毒蛋白的模板,對(duì)HBV的復(fù)制和表達(dá)起到正向調(diào)節(jié)的作用。HBV通過正鏈的負(fù)性調(diào)節(jié)元件,自我調(diào)節(jié)其自身的復(fù)制和表達(dá)。因此,HBV正鏈負(fù)性調(diào)節(jié)元件的鑒定及功能分析,不僅深化了對(duì)HBV分子病毒學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí),而且其本身作為HBV全基因組序列的一部分,有可能作為抗HBV基因治療的新的靶位,研究其作用方式,可為今后的抗病毒治療提供新的思路。
[Abstract]:Hepatitis B virus ( HBV ) infection will lead to acute and chronic hepatitis B , some of which have evolved into liver cirrhosis , even hepatocellular carcinoma , which is a pathogen which seriously endangers human health . At present , the therapeutic effect of anti - HBV infection is far from satisfactory . One of the important reasons is that it is not possible to quickly and effectively inhibit HBV replication expression and virus elimination . HBV is continuously replicated in the cytoplasm of infected liver cells and is difficult to be completely removed by antiviral drugs . The powerful replication capability of HBV in liver cells indicates that the virus has a strict and precise self - regulation mechanism to continuously replicate the virus and establish a persistent infection in vivo . Therefore , it is important to find the regulatory elements that play a key role in HBV replication and transcription , not only to gain insight into the molecular biological characteristics of the virus , but also to develop drugs for the development of new anti - HBV targets . The transcription and regulation of HBV positive strand ( antisense RNA , asRNA ) is very low in cell line or in vivo , and the replication and expression of HBV positive chain ( antisense strand ) is very low . The results showed that HBV nt453 - 250 sequence could down - regulate luciferase activity in non - hepatic cell A549 ( lung cancer cell line ) and Hela ( cervical cancer cell line ) . The results of this study indicate that the HBV nt453 - 250 sequence is a new negative regulatory element on the positive strand of HBV and has not been reported at home and abroad .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373.21

【引證文獻(xiàn)】

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1 余波;乙型肝炎病毒負(fù)性調(diào)節(jié)元件亞元件的鑒定及功能研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

2 楊揚(yáng);一個(gè)新的負(fù)性調(diào)節(jié)元件對(duì)乙型肝炎病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：1383168