鞘糖脂Gb3的配體結(jié)構(gòu)對(duì)其胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?/H1>
發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 20:35
本文關(guān)鍵詞：鞘糖脂Gb3的配體結(jié)構(gòu)對(duì)其胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?/strong> 出處：《東北師范大學(xué)》2007年碩士論文 論文類型：學(xué)位論文
更多相關(guān)文章： 鞘糖脂Gb3 志賀(氏)菌毒素 胞內(nèi)運(yùn)輸 表達(dá)載體
【摘要】： 志賀(氏)菌毒素(Shiga toxin)是主要由痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)產(chǎn)生的一種重要的致病毒力因子,由具有酶活性的A亞基和結(jié)合作用的B亞基兩部分構(gòu)成。志賀(氏)菌毒素的受體為鞘糖脂Gb3(globotriaosylceramide),其廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面。志賀(氏)菌毒素經(jīng)過(guò)復(fù)雜的胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部殺死細(xì)胞。志賀(氏)菌毒素與細(xì)胞表面的Gb3受體結(jié)合后,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),再由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最終到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)之中,志賀(氏)菌毒素的酶活部分使28S rRNA失活,從而抑制蛋白的合成。但是,目前的研究對(duì)于毒素在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制還有很多不清楚的地方。 本論文旨在研究志賀(氏)菌毒素B亞基N端的作用,通過(guò)基因克隆的方法對(duì)B亞基N端進(jìn)行修飾,并對(duì)修飾后B亞基的胞內(nèi)運(yùn)輸進(jìn)行研究。 本論文首先以pGlyc-KDEL質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出STxB的基因序列,并將其連接到帶有GST的pGEX-4T-1骨架載體上,構(gòu)建原核表達(dá)載體GST-STxB-pGEX-4T-1,并在大腸桿菌DH5α中通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),然后利用谷胱苷肽Sepharose 4B凝膠親和層析對(duì)重組的蛋白進(jìn)行純化。純化的蛋白采用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行檢測(cè),并且用高效液相Bio-sil SEC 250凝膠柱對(duì)重組的蛋白進(jìn)行分析,以確定其多聚體結(jié)構(gòu)。 我們對(duì)重組純化后的GST-STxB蛋白進(jìn)行了胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)难芯�。首先將N端修飾的蛋白GST-STxB和未做修飾的蛋白STxB(對(duì)照),分別與Hela細(xì)胞在4℃培養(yǎng)30min和37℃培養(yǎng)120min,然后利用間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察蛋白的位置,結(jié)構(gòu)表明N端修飾的GST-STxB蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸受到嚴(yán)重影響,說(shuō)明志賀(氏)菌毒素B亞基N端的結(jié)構(gòu),對(duì)其胞內(nèi)運(yùn)輸起著重要的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GST-STxB蛋白與細(xì)胞表面受體Gb3結(jié)合率的下降是導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的直接原因。
[Abstract]:Shiga toxin (s) (Shiga toxin) is mainly composed of Shigella dysenteriae (Shigella dysenteriae) is an important virulence factor production, is composed of two parts: a A subunit with enzyme activity and binding of the B subunit. Shiga toxin receptor (s) for glycosphingolipid Gb3 (globotriaosylceramide), which widely exists in the membrane of mammalian cells. Shiga toxin (s) after endocytosis complex inside the cell to kill cells. Shiga (Rockwell) combined with toxin and Gb3 receptors on the cell surface, through the reverse transport into the endoplasmic reticulum, the endoplasmic reticulum reach the cytoplasm in the cytoplasm, Shiga (Rockwell) part of the 28S inactivation of rRNA bacteria toxin enzyme, thereby inhibiting protein synthesis. However, the current study for many unclear mechanism of transport toxins in the cell.
The purpose of this study is to study the function of N terminal of shigella toxin B subunit, and to modify the N terminal of B subunit by gene cloning, and to study the intracellular transport of modified B subunit.
In this paper, pGlyc-KDEL was amplified from STxB gene sequence, and connect it to the pGEX-4T-1 with backbone vector GST, prokaryotic expression vector GST-STxB-pGEX-4T-1 was constructed and transformed into Escherichia coli DH5 alpha induced expression by IPTG, then using glutathione Sepharose 4B gel was purified by affinity chromatography on recombinant protein. The purified protein by SDS-PAGE and Western blot were detected by high performance liquid chromatography and Bio-sil SEC gel column of 250 recombinant proteins were analyzed to determine its multimeric structure.
We investigated the intracellular transport of recombinant purified GST-STxB protein. The N end of the modified protein GST-STxB and modified protein STxB (control), 30min and 120min were cultured in culture 37 C 4 C and Hela cells, and then observe the position of the protein under fluorescence microscopy using indirect immunofluorescence method the structure, showed that the N N-terminal modified GST-STxB protein intracellular transport have been seriously affected, that ('s) structure of Shiga toxin B subunit bacteria N end, plays an important role in the intracellular transport. Flow cytometry showed that GST-STxB protein and cell surface receptor Gb3 binding rate is decreased direct cause of transport barriers.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378
【共引文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前6條
1 郝苗;倪秀珍;劉曉宇;劉丹;;利用志賀毒素B亞基融合蛋白研究其胞內(nèi)降解作用[J];長(zhǎng)春師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年04期
2 孫媚華;陳遷;宋光泉;劉勇;杜建軍;;蓖麻毒蛋白的研究與應(yīng)用[J];廣東化工;2009年09期
3 蘇雅拉圖;黃鳳蘭;張繼星;李國(guó)瑞;呼和;吳俊華;;蓖麻毒蛋白的研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年04期
4 廖鵬;高宏偉;馬青原;劉文森;萬(wàn)家余;劉林娜;;蓖麻毒素在細(xì)胞內(nèi)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年01期
5 劉林娜;高宏偉;李吉平;萬(wàn)家余;劉文森;張闖;;P38/MAPK介導(dǎo)的蓖麻毒素誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究[J];中國(guó)畜牧雜志;2009年11期
6 蔣旭紅;;蓖麻毒蛋白的改性與抗癌活性[J];仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期
相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條
1 張小雪;蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物質(zhì)的分離、分析及作用機(jī)理研究[D];四川大學(xué);2007年
2 馬青原;EDEM2、ARFRP1及ERp29對(duì)蓖麻毒素逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[D];吉林大學(xué);2008年
3 劉樹(shù)雷;免疫毒素hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯對(duì)Hut-78細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年
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1 江德洪;植物滅鼠活性物質(zhì)提取分離及微膠囊化技術(shù)的研究[D];四川大學(xué);2004年
2 劉瓊;構(gòu)建表達(dá)蓖麻毒素A鏈與綠色熒光蛋白融合基因研究蓖麻毒素A鏈的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[D];浙江大學(xué);2006年
3 廖鵬;蓖麻毒素胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中KEEL和KDEL作用的研究[D];吉林大學(xué);2008年
4 賈超;蓖麻毒蛋白生物學(xué)活性及其應(yīng)用研究[D];蘭州理工大學(xué);2008年
5 戴小丹;糖鞘脂Gb3的配體結(jié)構(gòu)與配體胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)系[D];東北師范大學(xué);2009年
6 郝苗;利用志賀毒素B亞基融合蛋白研究其胞內(nèi)運(yùn)輸[D];東北師范大學(xué);2010年
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本文編號(hào)：1380012
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[Abstract]:Shiga toxin (s) (Shiga toxin) is mainly composed of Shigella dysenteriae (Shigella dysenteriae) is an important virulence factor production, is composed of two parts: a A subunit with enzyme activity and binding of the B subunit. Shiga toxin receptor (s) for glycosphingolipid Gb3 (globotriaosylceramide), which widely exists in the membrane of mammalian cells. Shiga toxin (s) after endocytosis complex inside the cell to kill cells. Shiga (Rockwell) combined with toxin and Gb3 receptors on the cell surface, through the reverse transport into the endoplasmic reticulum, the endoplasmic reticulum reach the cytoplasm in the cytoplasm, Shiga (Rockwell) part of the 28S inactivation of rRNA bacteria toxin enzyme, thereby inhibiting protein synthesis. However, the current study for many unclear mechanism of transport toxins in the cell.
The purpose of this study is to study the function of N terminal of shigella toxin B subunit, and to modify the N terminal of B subunit by gene cloning, and to study the intracellular transport of modified B subunit.
In this paper, pGlyc-KDEL was amplified from STxB gene sequence, and connect it to the pGEX-4T-1 with backbone vector GST, prokaryotic expression vector GST-STxB-pGEX-4T-1 was constructed and transformed into Escherichia coli DH5 alpha induced expression by IPTG, then using glutathione Sepharose 4B gel was purified by affinity chromatography on recombinant protein. The purified protein by SDS-PAGE and Western blot were detected by high performance liquid chromatography and Bio-sil SEC gel column of 250 recombinant proteins were analyzed to determine its multimeric structure.
We investigated the intracellular transport of recombinant purified GST-STxB protein. The N end of the modified protein GST-STxB and modified protein STxB (control), 30min and 120min were cultured in culture 37 C 4 C and Hela cells, and then observe the position of the protein under fluorescence microscopy using indirect immunofluorescence method the structure, showed that the N N-terminal modified GST-STxB protein intracellular transport have been seriously affected, that ('s) structure of Shiga toxin B subunit bacteria N end, plays an important role in the intracellular transport. Flow cytometry showed that GST-STxB protein and cell surface receptor Gb3 binding rate is decreased direct cause of transport barriers.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
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【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378
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3 劉樹(shù)雷;免疫毒素hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯對(duì)Hut-78細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年
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3 廖鵬;蓖麻毒素胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中KEEL和KDEL作用的研究[D];吉林大學(xué);2008年
4 賈超;蓖麻毒蛋白生物學(xué)活性及其應(yīng)用研究[D];蘭州理工大學(xué);2008年
5 戴小丹;糖鞘脂Gb3的配體結(jié)構(gòu)與配體胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)系[D];東北師范大學(xué);2009年
6 郝苗;利用志賀毒素B亞基融合蛋白研究其胞內(nèi)運(yùn)輸[D];東北師范大學(xué);2010年
，本文編號(hào)：1380012
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