本文關(guān)鍵詞：漢坦病毒S基因在大腸埃希菌中的克隆和表達(dá)　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:漢坦病毒(Hantavirus,HV)是腎綜合征出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)的病原體,可導(dǎo)致人類兩種疾病:HFRS和漢坦病毒肺綜合癥(Hantavirus Pulmonary Syndrom,HPS)。HV核蛋白(Nucleocapsid Protein,NP)是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,本文旨在對編碼NP蛋白的S基因在大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)中進(jìn)行克隆和表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 方法:以pGEM-T-L99S和pGEM-T-Z10S為模板,分別經(jīng)PCR擴增L99S和Z10S的ORF,前者經(jīng)EcoRI及XhoI雙酶切,后者經(jīng)SacI及XhoI雙酶切,純化后將二者與經(jīng)相同雙酶切所得的pET32a和pET28a載體大片段相連接,轉(zhuǎn)入E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中;在抗生素(pET32a為氨芐青霉素抗性,pET28a為卡那霉素抗性)篩選下,挑取陽性重組子。經(jīng)微量堿裂解法提取重組質(zhì)粒,以PCR法、酶切法和序列分析法進(jìn)行鑒定。繼而將正確定向克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)中,通過IPTG對重組菌進(jìn)行NP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),并使用HFRS患者陽性血清進(jìn)行Western Blot鑒定。同時,摸索不同濃度的IPTG和不同誘導(dǎo)時間對重組菌中目的蛋白產(chǎn)量的影響。 結(jié)果:PCR擴增獲得的L99 S基因和Z10 S基因定向克隆入pET32a和pET28a后,挑取抗性篩選的陽性重組子,分別擇其一命名為:pET32a-L99S、pET32a-Z10S、pET28a-L99S和pET28a-Z10S。PCR法、酶切法和序列分析對上述重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果顯示,L99 S基因和Z10 S基因已經(jīng)正確連接入pET32a和pET28a載體,且未改變讀碼框架。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)中,挑取陽性重組菌分別命名為E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S、E.coli BL21(DE3)/pET32a-Z10S、E.coli BL21(DE3)/pET28a-L99S和E.coli BL21(DE3)/pET28a-Z10S。IPTG誘導(dǎo)重組菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S和E.coli BL21(DE3)/pET32a-Z10S,結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的40%;
[Abstract]:Objective : Hantavirus ( HV ) is a pathogen of hemorrhagic fever with renal syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome . Nucleocapsid Protein ( NP ) is one of its main structural proteins . The purpose of this study is to clone and express the S gene encoding NP protein in E . coli BL21 ( DE3 ) and to identify the expression product . Methods : The ORFs of L99S and Z10 were amplified by PCR . The recombinant plasmids were digested with the same dienzyme and then transferred into E . coli Top10 competent cells . The recombinant plasmids were transformed into E . coli Top10 competent cells . The recombinant plasmids were transformed into E . coli Top10 competent cells . The recombinant plasmids were transformed into the expression host Ecoli BL21 ( DE3 ) competent cells . coli BL21 ( DE3 ) / pET32a - L99S , E . coli BL21 ( DE3 ) / pET32a - L99S and E .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1359946