本文關(guān)鍵詞：小鼠胚胎干細(xì)胞建系及人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立初探　出處：《浙江大學(xué)》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)是從植入前的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner mass cells,ICM)或原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells,PGCs)分離和克隆的 具有多潛能性細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為研究細(xì)胞分化,動物和人發(fā)育機(jī)制,闡 明基因功能,篩選藥物,細(xì)胞治療疑難雜癥等開辟了廣闊的空間。胚胎干細(xì)胞的 建系工作,是任何干細(xì)胞研究的基礎(chǔ)。優(yōu)良的建系方法和穩(wěn)定的培養(yǎng)體系,為后 期各種實驗鋪墊了道路。本實驗進(jìn)行了大量的方法和技術(shù)上的探索,旨在建立小 鼠和人胚胎干細(xì)胞系。 實驗首先用磷酸鈣共沉淀法將質(zhì)粒pEGFP-N2導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì) 胞系中,在熒光顯微鏡下以488nm激發(fā)光檢查陽性克隆,并進(jìn)行初步擴(kuò)增。經(jīng) G418篩選后,機(jī)械挑取EGFP強(qiáng)陽性表達(dá)的克隆,并在絲裂霉素C處理的小鼠 胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng),獲得純化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。20代以 后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍然表達(dá)綠色熒光蛋白。PCR檢測表明8代和18代轉(zhuǎn)染細(xì)胞均攜 帶有GFP標(biāo)志基因。對穩(wěn)定表達(dá)EGFP的干細(xì)胞系進(jìn)行堿性磷酸酶染色、擬胚 體和畸胎瘤形成的檢測,證明這些細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征。經(jīng)過擬胚體階段,可 進(jìn)一步分化成具有搏動能力的心肌細(xì)胞,分化百分率為30-40%,較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 60-70%的分化率低。 這些細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈綠色熒光,免疫組化染 色顯示具心肌細(xì)胞特異的cTnT分子標(biāo)志。該EGFP標(biāo)記的干細(xì)胞系帶有可進(jìn)行 原位、實時檢測的綠色熒光,可應(yīng)用于細(xì)胞移植和體內(nèi)分化的研究。 實驗第二部分選取超排后129 S1/SvImJ品系小鼠的優(yōu)質(zhì)囊胚,使用輻照后 凍存復(fù)蘇的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,對比高濃度酶短時間消化法和低濃 度酶長時間消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高濃度酶短時間消化法高效建立 了4株小鼠胚胎干細(xì)胞系,建系率為36.3%。堿性磷酸酶,核型分析,體外分化 和體內(nèi)分化能力以及小鼠胚胎干細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)志Oct-4和Nanog的檢測 等表明,4個MES細(xì)胞系均為典型的小鼠胚胎干細(xì)胞系。所建立的MES細(xì)胞系 為大規(guī)模培養(yǎng)MES細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)的實驗建立了理想的材料平臺。 實驗第三部分進(jìn)行了人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的初步探索,通過對培養(yǎng)液,血 清,血清替代物,以及各種生長因子的調(diào)配,以及飼養(yǎng)層狀態(tài)的調(diào)節(jié),成功建立
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R321

【引證文獻(xiàn)】

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2 張以濤;小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及初步應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 蘇敏;順鉑誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞毒性相關(guān)基因的篩選及其初步分析[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：1353259