本文關鍵詞：EBV病毒LMP1通過信號轉導通路上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達的分子機制　出處：《中南大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 我們的前期工作從中國人鼻咽癌細胞株CNE2的基因組DNA文庫中克隆了一個具有細胞惡性轉化功能的基因Tx。將該基因轉染小鼠上皮細胞系JB6，可使JB6細胞在軟瓊脂形成集落，且能使裸鼠成瘤。DNA測序及生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Tx基因包含人類免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)kappa輕鏈基因片段C區(qū)(constant region)、J區(qū)(joining region)，但未發(fā)現(xiàn)V區(qū)(vauriable region)。與正常的Ig kappa基因的JC區(qū)基因片段相比較，發(fā)現(xiàn)Tx基因與之同源性高達99％，因此推測Tx基因是一異常的人Ig kappa輕鏈基因。 經典免疫學理論認為正常機體中只有B淋巴細胞才能表達免疫球蛋白，其它正常的體細胞，包括上皮細胞是不表達免疫球蛋白的。然而以Tx基因為線索，我們采用免疫組化和Northern Blotting等策略發(fā)現(xiàn)上皮來源的腫瘤細胞包括MCF-7(人乳腺癌細胞系)、MGC(人胃癌細胞系)、SW480(結腸癌細胞系)、HeLa(人宮頸癌細胞系)、鼻咽癌細胞系及鼻咽癌組織表達Ig kappa恒定區(qū)蛋白及mRNA，并通過原位雜交發(fā)現(xiàn)Ig kappa表達與宮頸組織癌變的階段性密切相關。同時，我們在正常人群和鼻咽癌病人人群中證實了Ig kappa基因上的SNP3、SNP4、SNP5和SNP6四個SNP位點，其中連鎖的SNP4-SNP3基因型中的雜合型AT-GC可能是鼻咽癌患病的遺傳風險因素。 對Tx基因表達的初步研究表明該基因在鼻咽癌細胞株低表達，而在EB病毒陽性的B95-8及Raji細胞中Tx基因表達強烈。此外，Western印跡分析表明整合了LMP1的鼻咽癌細胞系CNE1-LMP1中Ig kappa輕鏈明顯強于CNE1細胞的表達水平。這些現(xiàn)象啟發(fā)我們思考LMP1在上調鼻咽癌細胞表達Ig kappa輕鏈中所發(fā)揮的作用，并促使我們利用鼻咽癌細胞系為實驗模型，從信號傳導角度對這一異�，F(xiàn)象發(fā)生的分子機制進行較為系統(tǒng)地探索性研究，旨在為揭示非淋巴細胞系的其它上皮性腫瘤細胞表達免疫球蛋白分子機制提供有意義的啟示和基礎。 1．LMP1上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達 首先，以四環(huán)素衍生物強力霉素Dox劑量誘導LMP1表達的細胞系Tet-on-LMP1 HNE2及穩(wěn)定轉染LMP1的鼻咽癌細胞HNE2-LMP1為基本模型，采用不同劑量Dox誘導LMP1表達后驗證鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈的表達。Tet-on-LMP1-HNE2細胞用0，0.06，0.6，6.0μg／ml的Dox誘導LMP1表達后，PT-PCR分析其Ig kappa輕鏈保守的恒定區(qū)C區(qū)mRNA表達，發(fā)現(xiàn)Ig kappa輕鏈恒定區(qū)mRNA隨LMP1誘導表達增加而增加；Western Blotting結果表明，隨著Dox誘導劑量增加，LMP1表達劑量依賴性增加，同時Ig kappa輕鏈蛋白水平也呈相應程度地增強。Dox誘導后進行細胞內kappa輕鏈蛋白染色，，F(xiàn)ACS結果表明，隨著Dox劑量增加，Ig kappa輕鏈特異性平均熒光強度也以同樣的趨勢增加。 然后，采用特異性靶向LMP1的脫氧核酶阻斷LMP1表達的策略驗證鼻咽癌細胞表達Ig kappa輕鏈。結果發(fā)現(xiàn)，特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1抑制HNE2-LMP1鼻咽癌細胞LMP1表達后明顯降低Ig kappa輕鏈蛋白水平，而對LMP1陰性鼻咽癌細胞HNE2中Ig kappa輕鏈含量無明顯影響。通過正、反兩方面實驗證實鼻咽癌細胞的確表達Ig kappa輕鏈mRNA及蛋白，并且LMP1能夠上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈mRNA及蛋白水平。 2．LMP1通過活化NFκB，AP-1信號通路上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈 生物信息學預測發(fā)現(xiàn)異常人Ig kappa輕鏈基因包含了NF-κB和AP-1這兩個關鍵的轉錄因子結合位點。NF-κB位點位于增強子(Enhancer)中；AP-1位點位于增強子之后的J-C內含子區(qū)，推測這兩個轉錄因子都有可能作用于增強子，從而調節(jié)Ig kappa輕鏈基因表達。 在驗證LMP1從mRNA轉錄水平及蛋白質水平上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈的基礎上，進一步研究參與此事件的信號轉導通路。研究表明，Ig kappa基因Jκ-Cκ區(qū)域之間的NF-κB結合位點對B細胞Ig kappa表達十分重要，其下游AP-1結合位點對B細胞Ig kappa表達也起一定作用，而在LMP1激活的多條信號通路中，NF-kB及AP-1被認為是最重要信號通路，其活化可導致大多數(shù)LMP1下游靶基因的過表達。因此，我們提出鼻咽癌細胞異位表達Ig是否與LMP1異常活化NF-kB及AP-1信號通路相關。 首先采用NF-κB抑制劑Bay11-7082、JNK抑制劑SP600125分別處理HNE2及HNE2-LMP1鼻咽癌細胞，Western Blotting分析兩條通路不同層面效應分子的變化，結果顯示，Bay11-7082劑量依賴性地抑制LMP1誘導的IκBα磷酸化及IκBα蛋白的降解，SP600125劑量依賴性地抑制LMP1誘導的JNK的磷酸化，對JNK的總蛋白表達無明顯影響，Western Blotting及FACS結果顯示兩種抑制劑均劑量依賴性地降低Ig kappa蛋白表達及Ig kappa特異性平均熒光強度。 我們前期工作表明IκBα顯性負性突變體DNMIκBα和c-Jun顯性負性突變體TAM67可以有效地抑制LMP1所誘導的NF-κB和AP-1信號傳導通路活化。通過Western Blotting及FACS技術分析穩(wěn)定表達DNMIκBα的鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1-DNMIκBα及穩(wěn)定表達TAM67的鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1-TAM67中Ig kappa輕鏈含量，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，Ig kappa輕鏈蛋白及Ig kappa特異性平均熒光強度在兩株穩(wěn)定轉染突變體細胞中明顯降低。證實LMP1通過活化NF-κB、AP-1信號傳導通路上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達。 3．LMP1通過NF-κB和AP-1信號通路上調Ig kappa輕鏈基因內含子增強子iEκ活性 基因的表達調控需要順式作用元件與反式作用因子共同參與。在明確轉錄因子NF-κB、AP-1通過NF-κB、AP-1信號傳導通路參與LMP1上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達基礎上，我們期望進一步明確與轉錄因子NF-κB、AP-1相互作用的順式作用元件。在B細胞中，Ig kappa基因表達的必需條件之一是增強子活化。Ig kappa輕鏈內含子增強子內存在NF-κB結合位點，其下游為AP-1結合位點，LMP1是否通過NF-κB、AP-1信號介導活化內含子增強子而上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達? 因此，我們將包含完整iEκ(含κB位點)及AP-1位點的Ig kappa基因組DNA克隆到由SV40啟動子驅動不含任何增強子元件的熒光素酶報告基因pGL3-promoter載體質粒上，通過熒光素酶強度反映iEκ增強子活性。我們首先構建了報道基因質粒pwt575。通過Luciferase報道基因分析發(fā)現(xiàn)轉染pwt575后，LMP1陰性的HNE2細胞熒光素酶活性增加～5倍，而HNE2-LMP1細胞增加～35倍，表明iEκ增強子在表達免疫球蛋白的鼻咽癌細胞中功能性活化，在LMP1陰性鼻咽癌細胞中活性較低，在LMP1陽性鼻咽癌細胞HNE2-LMP1中活性顯著增高，呈現(xiàn)的活性狀態(tài)與Ig kappa輕鏈蛋白在這兩株細胞中的表達水平相吻合。因此認為，增強子活化是鼻咽癌細胞表達Ig kappa輕鏈的重要分子機制。 為進一步確定NF-κB和AP-1信號通路是否參與LMP1上調鼻咽癌細胞的iEκ活性，在野生型pwt575質粒基礎上，利用基于重疊延伸PCR(overlap extension PCR)體外定點突變技術將pwt575質粒中的κB位點突變構建pmt575．κB質粒，將AP-1位點突變構建pmt575．AP-1質粒，將κB和AP-1位點同時突變構建pmt575．κB．AP-1質粒，將四種質粒分別轉染HNE2和HNE2-MP1鼻咽癌細胞。結果發(fā)現(xiàn)，轉染pwt575后，HNE2細胞熒光素酶活性增加～6倍，而HNE2-LMP1細胞熒光素酶活性增加～160倍，說明LMP1能夠明顯上調iE_κ活性。HNE2-LMP1細胞轉染κB位點突變的pmt575．κB質粒后，熒光素酶活性增加幅度由～160倍降低到～70倍；轉染AP-1位點突變的pmt575．AP-1質粒后，增加幅度由～160倍降低到～90倍；轉染κB位點和AP-1位點同時突變的pmt575．κB．AP-1質粒后，增加幅度由～160倍降低到～87倍；說明Ig kappa輕鏈基因中κB和AP-1位點在LMP1活化鼻咽癌細胞Ig kappa內含子增強子事件中起重要作用，并且κB位點對iE_κ增強子活性的影響作用略高于AP-1位點，提示NF-κB信號通路在LMP1上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達中起主導作用。κB和AP-1位點同時突變并未進一步降低iE_κ活性，表明介導LMP1對iE_κ調控的NF-κB和AP-1兩條信號通路之間不具協(xié)同效應。 此外，將pwt575報道基因質粒轉染HNE2和HNE2-LMP1鼻咽癌細胞后分別用20μm NF-κB抑制劑Bay11-7082、JNK抑制劑SP600125處理12小時，發(fā)現(xiàn)LMP1誘導的pwt575報道基因活性顯著降低。將pwt575質粒轉染HNE2-LMP1-DNMIκBα及HNE2-LMP1-TAM67鼻咽癌細胞，其報道基因活性在這兩株穩(wěn)定表達突變體細胞中顯著低于其親本細胞HNE2-LMP1。通過幾方面實驗證實NF-κB、AP-1信號傳導通路參與了LMP1對iEκ增強子活性增強作用。 在明確轉錄因子NF-κB和AP-1參與激活的順式調控元件為iEκ增強子基礎上，根據(jù)人Ig kappa基因iEκ的NF-κB位點序列及下游AP-1位點序列及構建突變質粒的突變序列分別合成生物素標記的野生型和突變型NF-κB、AP-1寡核苷酸探針。利用EMSA和Supershift-EMSA方法進一步分析其與Ig kappa基因相應DNA的結合能力及這兩個二聚體轉錄因子的亞單位組成。結果表明，HNE2-LMP1細胞核蛋白與Ig kappa基因中κB DNA結合能力明顯高于HNE2細胞。穩(wěn)定表達IκBα顯性負性突變體的鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1-DMNIκB其核蛋白結合Ig kappa基因κB DNA能力與親本細胞HNE2-LMP1相比明顯降低。20μm Bay11-7082處理HNE2-LMP1細胞12小時后，其核蛋白與Ig kappa基因κB DNA結合能力明顯降低。而生物素標記突變型NF-κB DNA探針完全不能與上述細胞核蛋白結合。Supershift結果表明直接結合到Ig kappa基因內含子增強子上的NF-κB亞單位包括p65和p52。 類似地，HNE2-LMP1細胞核蛋白與Ig kappa基因中AP-1 DNA結合能力明顯高與HNE2細胞。穩(wěn)定表達c-Jun顯性負性突變體的鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1-TAM67其核蛋白結合Ig kappa基因AP-1 DNA的能力與親本細胞HNE2-LMP1相比明顯降低。20μm SP600125處理HNE2-LMP1細胞12小時后，其核蛋白與Ig kappa基因中AP-1 DNA結合能力明顯降低。而生物素標記突變型AP-1 DNA探針完全不能與上述細胞核蛋白結合。Supershift結果表明結合到Ig kappa基因AP-1位點的轉錄因子包括c-Jun和c-Fos。 4．LMP1通過ERK信號通路介導，調控轉錄因子Ets-1磷酸化活化靶向3’Eκ從而上調Ig kappa輕鏈表達 除內含子增強子(iEκ)外，調節(jié)Ig kappa輕鏈基因表達另一個重要增強子元件是位于Cκ基因片段下游的3’端增強子(3’Eκ)。生物信息學分析及相關文獻報道表明，3’Eκ上存在轉錄因子PU．1及Ets相關蛋白一致性結合位點，基于EBV-LMP1在鼻咽癌細胞中可通過ERK介導Ets-1磷酸化活化的前期工作基礎，我們推測可能存在LMP1—ERK／MAPK—Ets這樣一條信號轉導通路，在調控Ig kappa輕鏈表達中起一定作用。 利用ERK特異性抑制劑PD98059阻斷ERK的活性，通過IP-Western Blotting及Western Blotting檢測Ets-1磷酸化水平及Ig kappa表達量變化，結果表明PD98059能劑量依賴性地抑制LMP1誘導的ERK磷酸化、抑制LMP1上調的轉錄因子Ets-1磷酸化及Ig kappa輕鏈表達。證實LMP1通過ERK信號通路介導轉錄因子Ets-1磷酸化活化上調Ig kappa輕鏈表達。 為進一步確定LMP1通過ERK信號通路的介導上調轉錄因子Ets-1磷酸化及Ig kappa輕鏈表達與3’E_κ增強子相關。根據(jù)人kappa基因3’E_κ上PU位點序列及將PU核心序列突變分別合成生物素標記的野生型和突變型PU探針，通過Supershift-EMSA分析，在鼻咽癌細胞中，結合到Ig kappa基因PU位點的轉錄因子為Ets-1而非B細胞中的PU．1，提示鼻咽癌細胞Ig kappa基因3’端增強子活化機制與B細胞不完全相同。通過EMSA分析，我們發(fā)現(xiàn)LMP1表達顯著增強鼻咽癌細胞中轉錄因子Ets-1與Ig kappa基因PU序列的結合能力。50μm PD98059完全抑制了LMP1誘導的轉錄因子Ets-1與Ig kappa基因PU序列的結合，生物素標記突變型PU DNA探針完全不能與上述細胞核蛋白結合形成Ets-1-DNA復合物。證實LMP1可通過活化ERK信號通路促進轉錄因子Ets-1與3’Eκ增強子中PU位點結合進而上調鼻咽癌細胞中Ig kappa輕鏈表達。 利用本實驗室對信號轉導積累的研究優(yōu)勢，我們從外界致病因素EBV-LMP1對信號轉導的異常調控為切入點，以鼻咽癌細胞為模型，研究上皮性腫瘤異常表達Ig的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)病毒編碼的瘤蛋白LMP1介導轉錄因子異常激活在上調鼻咽癌細胞Ig kappa表達中具有重要意義，并創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)表達Ig的鼻咽癌細胞的kappa內含子增強子iEκ具有功能活性，其活性受到LMP1調控。通過實驗確定了LMP1活化的三條主要信號轉導通路、三個主要的轉錄因子及受LMP1調控的iEκ和3’Eκ這兩個順式增強子元件，證實LMP1經NF-κB、JNK／MAPK、ERK／MAPK信號通路介導，分別促進活化的轉錄因子NF-κB、AP-1、Ets-1與與Ig kappa基因的相應位點結合，從而上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達。此外發(fā)現(xiàn)LMP1通過ERK信號通路調控轉錄因子Ets-1靶向3’Eκ而上調鼻咽癌細胞Ig kappa輕鏈表達的機制與B細胞通過轉錄因子PU．1活化3’Eκ的機制不完全相同。 通過本課題的研究，我們對鼻咽癌細胞異位表達免疫球蛋白的分子機制有了新的科學發(fā)現(xiàn)，所獲得的原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)加深了我們對上皮性腫瘤細胞表達免疫球蛋白這一現(xiàn)象的理解。由于其它致瘤病毒編碼的瘤蛋白，如：HBV的X蛋白、HPV的E6和E7蛋白，能夠激活NF-κB、AP-1、ERK等信號傳導通路，因此其有可能通過類似于EBV-LMP1的分子機制調控上皮性腫瘤中Ig kappa輕鏈表達，這對于建立致瘤病毒與上皮性腫瘤異常表達Ig之間的聯(lián)系、為揭示非淋巴細胞系的其它上皮性腫瘤細胞表達免疫球蛋白分子機制提供了新的啟示與思考。對經典免疫學關于免疫球蛋白表達理論將是一個重要補充。并為從一個新的角度了解腫瘤這一復雜性狀疾病提供理論證據(jù)。
[Abstract]:In our previous work, a gene Tx with cell malignant transformation function was cloned from the genomic DNA Library of the Chinese nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2. The gene transfected into mouse epithelial cell line JB6 could make JB6 cells form colony in soft agar and make nude mice into tumor. DNA sequencing and bioinformatics analysis showed that Tx gene contained human Immunoglobulin (Ig) kappa light chain gene fragment C region (constant region), J region (joining region), but no J area was found. Compared with the normal JC gene fragment of Ig kappa gene, we found that the Tx gene was 99% homology with it, so we speculated that Tx gene is an abnormal human Ig kappa light chain gene.
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R739.63

【參考文獻】

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本文編號：1346093