發(fā)布時(shí)間：2017-12-28 12:33

  本文關(guān)鍵詞：腺病毒介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《解放軍醫(yī)藥雜志》2014年05期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的探討腺病毒載體介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)的可行性,以及VEGF轉(zhuǎn)染對UCMSCs功能的影響。方法構(gòu)建VEGF165-EGFP基因重組腺病毒載體,分離和培養(yǎng)UCMSCs,攜增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒載體轉(zhuǎn)染UCMSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,確定最佳病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)。將細(xì)胞分為VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組及對照組3組,依據(jù)最佳MOI值轉(zhuǎn)染并收集細(xì)胞,采用蛋白印跡法(Western blotting)檢測VEGF及Akt表達(dá)變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測VEGF蛋白表達(dá)情況。采用CCK-8法評價(jià)轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖的影響。結(jié)果腺病毒介導(dǎo)的VEGF165-EGFP基因能夠成功轉(zhuǎn)染UCMSCs,且VEGF基因在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并能分泌到細(xì)胞外。轉(zhuǎn)染后48 h VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組VEGF、Akt水平顯著高于EGFP空載組和對照組(P0.05);轉(zhuǎn)染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中即檢測到VEGF的表達(dá)和分泌,在轉(zhuǎn)染后第4天達(dá)到高峰,且VEGF表達(dá)顯著高于EGFP空載組及對照組(P0.01),以后逐漸下降,并穩(wěn)定表達(dá)一定時(shí)間。CCK-8法檢測結(jié)果顯示,介導(dǎo)VEGF基因轉(zhuǎn)染的腺病毒對UCMSCs增殖無明顯影響。結(jié)論腺病毒介導(dǎo)VEGF基因能夠成功轉(zhuǎn)染UCMSCs,保持其原有生物學(xué)特性,并能持續(xù)高效表達(dá)VEGF,為通過VEGF基因聯(lián)合UCMSCs治療獲得糖尿病下肢血液循環(huán)重建的可行性提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective to investigate the feasibility of transfection of umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs) by adenovirus vector mediated vascular endothelial growth factor (VEGF) and the effect of VEGF transfection on UCMSCs function. Methods the recombinant adenovirus vector containing VEGF165-EGFP gene, isolated and cultured UCMSCs with enhanced green fluorescent protein (EGFP) recombinant adenovirus vector was transfected into UCMSCs cells, observe the transfection effect under inverted fluorescence microscope, the transfection efficiency was detected by flow cytometry, determine the best virus (MOI) infection. The cells were divided into 3 groups: VEGF-EGFP transfection group, EGFP no load group and control group. The cells were transfected and collected according to the best MOI value, and the expression of VEGF and Akt were detected by Western blot (Western blotting). The expression of VEGF protein was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effect of transfection on the proliferation of UCMSCs was evaluated by CCK-8 method. Results the adenovirus mediated VEGF165-EGFP gene can be successfully transfected into UCMSCs, and the VEGF gene can be transcribed and expressed in the cell, and can be secreted out of the cell. 48 h VEGF-EGFP VEGF transfection group and Akt levels after transfection was significantly higher than that of EGFP load group and the control group (P0.05); 48 h after transfection by ELISA assay in culture supernatant was detected that the expression and secretion of VEGF in VEGF-EGFP transfected cells, reached a peak in the fourth day after transfection, and the expression of VEGF was significantly higher than that of EGFP vector group and the control group (P0.01), then gradually decreased, and stable expression of a certain period of time. The results of CCK-8 assay showed that the adenovirus mediated VEGF gene transfection had no significant effect on the proliferation of UCMSCs. Conclusion adenovirus mediated VEGF gene can be successfully transfected into UCMSCs, maintaining its original biological characteristics and expressing VEGF continuously and efficiently. It provides a theoretical basis for the feasibility of VEGF gene combined with UCMSCs in the treatment of diabetic lower limb blood circulation reconstruction.
【作者單位】： 解放軍白求恩國際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科;河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科;解放軍白求恩國際和平醫(yī)院輸血科;
【基金】：河北省自然科學(xué)基金課題(H2013505067)
【分類號】：R329.2
【正文快照】： 研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular en-dothelial growth factor,VEGF)能加速側(cè)支循環(huán)的建立,在血管新生中起關(guān)鍵作用,但由于VEGF屬多肽類生長因子,在體內(nèi)半衰期短,提純較為困難,不適合作為藥物直接用于臨床。高增殖潛能和定向歸巢特性使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1346043