本文關(guān)鍵詞：嗅鞘細(xì)胞無血清上清液誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞定向分化及分化后細(xì)胞活力檢測　出處：《中國修復(fù)重建外科雜志》2014年05期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的探討體外采用嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)無血清上清液誘導(dǎo)小鼠C17.2神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)向神經(jīng)元定向分化及分化后的細(xì)胞活力。方法采用新生3 d昆明小鼠嗅球,分離培養(yǎng)OECs,并制備無血清上清液。C17.2 NSCs置于含15%FBS的H-DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),傳至第3代,待細(xì)胞生長至80%融合時,分別加入OECs無血清上清液(實驗組)、H-DMEM/F12培養(yǎng)基(對照組)誘導(dǎo)培養(yǎng);以未誘導(dǎo)的C17.2NSCs作為空白對照組。倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞生長情況,于誘導(dǎo)5 d后收集細(xì)胞行微管相關(guān)蛋白2(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)及β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)免疫熒光染色鑒定,Western blot檢測細(xì)胞巢蛋白(Nestin)、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2蛋白表達(dá)情況,檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率并行MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果實驗組:誘導(dǎo)后24 h細(xì)胞胞體開始收縮,3 d后分化的細(xì)胞明顯增多,突觸增長;對照組:誘導(dǎo)后24 h細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,3 d后細(xì)胞胞體皺縮,細(xì)胞核質(zhì)濃縮,并發(fā)生細(xì)胞裂解、破碎。誘導(dǎo)后5 d,免疫熒光染色示實驗組分化后細(xì)胞β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達(dá)均呈陽性,對照組及空白對照組均無表達(dá)。Western blot檢測顯示實驗組中NSCs標(biāo)志物Nestin蛋白表達(dá)明顯減少,神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達(dá)增加,與對照組及空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。實驗組LDH漏出率為130.60%±6.86%,顯著低于對照組的178.20%±5.44%;細(xì)胞活力為62.20%±3.82%,顯著高于對照組的18.00%±3.83%;比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但均低于空白對照組的100%(P0.05)。結(jié)論含有OECs分泌蛋白的OECs無血清上清液不僅能誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化,還能維持分化后細(xì)胞活力。
[Abstract]:Objective to investigate the differentiation and differentiation of C17.2 neural stem cells (neural stem cells, NSCs) into neurons after olfactory ensheathing cells (OECs) serum-free supernatant in vitro. Methods a new 3 D Kunming mouse olfactory bulb was used to isolate and culture OECs, and the serum-free supernatant was prepared. C17.2 NSCs was cultured in H-DMEM/F12 medium containing 15%FBS, and spread to the third generation. When the cells grew to 80% fusion, they were added to OECs supernatant without serum (experimental group) and H-DMEM/F12 medium (control group) to induce culture. C17.2NSCs was used as blank control group. The growth of cells after induction were observed under inverted microscope. In 5 d after the induction, cells were collected for microtubule associated protein 2 (microtubuleassociated protein 2, MAP-2) and beta tubulin III (beta -tubulin- III) immunofluorescence staining, Western blot assay (Nestin), nestin expression of beta -tubulin- III and MAP-2 protein detection. Lactate dehydrogenase (lactate dehydrogenase, LDH) the leakage rate of cell viability was detected by MTT in parallel. Results in the experimental group, cell bodies began to contract 24 h after induction, and the differentiated cells increased significantly after 3 D. Synapse growth was observed in the control group. After 24 h induction, the morphology of cells did not change significantly. After 3 D, the cell body shrinked, the cytoplasm was condensed, and the cells lysed and broken. After induction of 5 d, immunofluorescence staining showed that the expression of beta -tubulin- III and MAP-2 in the experimental group were positive, and there was no expression in the control group and the blank control group. Western blot detection showed that the expression of Nestin protein of NSCs markers in experimental group was significantly reduced, and the expression of neuronal markers beta -tubulin- III and MAP-2 increased, compared with control group and blank control group, the difference was statistically significant (P0.05). The leakage rate of LDH in the experimental group was 130.60% + 6.86%, which was significantly lower than that in the control group (178.20% + 5.44%), and the cell viability was 62.20% + 3.82%, which was significantly higher than that in the control group (18% + 3.83%). The difference was statistically significant (P0.05), but it was lower than that in the control group 100% (P0.05). Conclusion the OECs serum-free supernatant containing OECs secreted protein can not only induce the differentiation of NSCs into neurons, but also maintain the cell viability after differentiation.
【作者單位】： 解放軍第163醫(yī)院(湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科;湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(81371358) 湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(GX2012B230)~~
【分類號】：R329
【正文快照】： 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一類能自我更新、增殖及向3種神經(jīng)類型細(xì)胞分化的成體干細(xì)胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)和再生中具有重要作用。研究表明,NSCs的分化方向受局部微環(huán)境調(diào)控,包括周圍相聯(lián)系的各種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和體內(nèi)各種細(xì)胞因子等[1-6],其中主要

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1343366