本文關(guān)鍵詞：精子發(fā)生相關(guān)蛋白Stra8與Setd8的相互作用研究　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：Stra8 (stimulated by retinoic acid gene8)是一種視黃酸(retinoic acid,RA)反應(yīng)基因,在成年小鼠睪丸中特異性表達(dá),同時(shí)其蛋白在睪丸中的表達(dá)具有階段利細(xì)胞特異性。Stra8對(duì)于精子發(fā)生的過(guò)程是至關(guān)重要的。Stra8基因敲除的雄性小鼠不育,精子發(fā)生過(guò)程受到嚴(yán)重影響。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中以Stra8蛋白為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠精原干細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選與Stra8目互作用的蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與Stra8相互作用的蛋白-Setd8蛋白。Setd8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化H4K20的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,在許多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但目前為止未見(jiàn)在生精細(xì)胞中的研究。本研究主要探討精子發(fā)生相關(guān)蛋白Stra8與Setd8的相互作用機(jī)制,為以后進(jìn)一步研究Stra8與Setd8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。第一,利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),明確Stra8與Setd8能夠相互轉(zhuǎn)錄調(diào)控。(一)Setd8對(duì)Stra8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。構(gòu)建含有Stra8啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pGL3-Stra8Pro,與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,檢測(cè)熒光素酶活性,確定Stra8啟動(dòng)子有轉(zhuǎn)錄活性。然后用空載pCMV-HA、pCMV-HA-Setd8分別與pGL3-Stra8Pro共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性,確定Setd8蛋白能夠抑制Stra8啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。此外,我們?cè)谏鲜鱿到y(tǒng)中加入0、0.0625μg、0.125μg、0.25μg和0.5lμg不同含量的pCMV-HA-Setd8,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同含量的Setd8蛋白對(duì)Stra8啟動(dòng)子活性無(wú)顯著影響。(二)Stra8對(duì)Setd8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。構(gòu)建含有Setd8不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pGL3-Setd8Pro,分別與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,檢測(cè)熒光素酶活性,確定Setd84種不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子均有轉(zhuǎn)錄活性,其中在Setd8 mRNA上游-1499-+1bp的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。因此我們選擇pGL3-Setd8ProF2R用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后用空載pCMV-Myc、 pCMV-Myc-Stra8分別與pGL3-Setd8ProF2R共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性,確定Stra8蛋白能夠增強(qiáng)Setd8啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。此外,我們?cè)谏鲜鱿到y(tǒng)中加入0、0.0625μg、 0.125μg、0.25μg和0.5gg不同含量的pCMV-Myc-Stra8。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入的蛋白量達(dá)到0.25μ,g時(shí),能顯著增強(qiáng)Setd8啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。第二,Stra8與Setd8相互作用位點(diǎn)分析。(一)根據(jù)Setd8含有的結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建含有五種不同長(zhǎng)短的Setd8截短片段的pGADT7重組質(zhì)粒。將Setd8全長(zhǎng)、五種截短片段和Setd8NO.50(81-286aa)分別與pGBKT7-Stra8片段共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中,并在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-LTAH/X-α-gal中培養(yǎng)。結(jié)果顯示：Setd8全長(zhǎng)以及構(gòu)建的五個(gè)Setd8截短片段,均不能與Stra8片段相互作用,而Setd8NO.50 (81-286aa)與Stra8片段能夠相互作用。(二)構(gòu)建Setd8F1R1(全長(zhǎng))及4種不同長(zhǎng)短的Setd8截短片段的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建完成后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這五種重組質(zhì)粒蛋白都能正確表達(dá)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒、pCMV-HA-Setd8NO.50分別與pCMV-Myc-Stra8全長(zhǎng)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,在293T細(xì)胞總蛋白中用鼠抗C-Myc進(jìn)行免疫共沉淀,用兔抗HA進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果表明,只有Setd8NO.50能夠與Stra8目互作用,其余的重組質(zhì)粒都沒(méi)有相互作用。第三,利用免疫共沉淀確定Setd8與Stra8相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。構(gòu)建3種不同長(zhǎng)短的Stra8截短片段的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建完成后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這三種重組質(zhì)粒只有一種能正確表達(dá)蛋白,其余兩種不表達(dá)蛋白。然后將能正確表達(dá)蛋白的質(zhì)粒與pCMV-HA-Setd8全長(zhǎng)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,在293T細(xì)胞總蛋白中用鼠抗C-Myc進(jìn)行免疫共沉淀,用兔抗HA進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果表明,構(gòu)建的Stra8截短片段與Setd8全長(zhǎng)沒(méi)有相互作用。第四,Stra8過(guò)表達(dá)對(duì)生精細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。(一)利用SRB細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究Stra8穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的精原細(xì)胞株Stra8-GC1與對(duì)照組Control-GC1在細(xì)胞增殖上是否有差異。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)使得起始細(xì)胞數(shù)相同,分別在鋪板后4h (day0)、day1、day2、day3、day4、day5時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,繪制生長(zhǎng)曲線。由結(jié)果可知,每個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)OD值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明Stra8對(duì)體外培養(yǎng)的精原細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。其次,我們利用流式細(xì)胞儀對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞周期的檢測(cè),結(jié)果表明,Stra8過(guò)表達(dá)對(duì)精原細(xì)胞細(xì)胞周期的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與SRB增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合。綜上結(jié)果說(shuō)明Stra8對(duì)體外培養(yǎng)的精原細(xì)胞的分裂增殖無(wú)明顯影響。(二)Stra8過(guò)表達(dá)對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響。利用PI/AnnexinV雙標(biāo)記檢測(cè)Stra8-GC1和Control-GC1在正常培養(yǎng)狀態(tài)下凋亡的發(fā)生率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Stra8-GC1的早期凋亡率比Control-GC1的早期凋亡低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第五,同步化Stra8過(guò)表達(dá)細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞周期不同時(shí)期Stra8和Setd8 mRNA水平。(一)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化,最終用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)Stra8-GC1細(xì)胞3天后,G0/G1期比例在60%以上；利用胸苷處理細(xì)胞20h后,S期比例能達(dá)到65%。利用諾考達(dá)唑處理8h后,將細(xì)胞阻滯在G2/M期。使用“拍打”的方法收集細(xì)胞。G2/M期比例達(dá)到90%以上,純度較高。(二)利用RT-PCR檢測(cè)上述同步化方法后的細(xì)胞周期不同時(shí)期Stra8和Setd8 mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Stra8-GC1細(xì)胞中,Stra8和Setd8 mRNA水平在G0/G1期最低,至S期逐漸升高,Setd8 mRNA水平在G2/M期保持不變,而Stra8有一定的下降。通過(guò)上述研究,我們明確了Stra8和Setd8能夠相互進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Stra8與Setd8蛋白能夠相互作用,但其相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Stra8對(duì)體外培養(yǎng)的生精細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響,而Stra8穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的精原細(xì)胞早期凋亡率比對(duì)照組低。Stra8和Setd8 mRNA水平在精原細(xì)胞不同的細(xì)胞周期時(shí)相中表達(dá)具有一定的規(guī)律性。這些研究為以后進(jìn)一步研究Stra8與Setd8在精子發(fā)生中的作用提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R321.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭英;張露萍;王海燕;;Stra8酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活活性分析[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2011年30期

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本文編號(hào)：1319880