本文關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球絳蟲果糖二磷酸醛縮酶的生物信息學(xué)分析及其表達(dá)與活性檢測(cè)

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【摘要】：目的利用生物信息學(xué)方法分析細(xì)粒棘球絳蟲果糖二磷酸醛縮酶(EgFBPA)的結(jié)構(gòu)和功能特征,并利用基因工程技術(shù)進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化,獲得活性蛋白。方法利用多種生物信息學(xué)軟件分析EgFBPA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物學(xué)以及免疫功能特征;用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HandⅢ對(duì)重組質(zhì)粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的基因片段,亞克隆入表達(dá)載體pET30a,篩選重組克隆并測(cè)序,將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,用異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白;用Ni-NTA柱純化重組蛋白,并建立酶反應(yīng)體系,通過(guò)NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的變化測(cè)定重組蛋白EgFBPA的酶催化活性。結(jié)果 EgFBPA基因全長(zhǎng)1 092bp,編碼363個(gè)氨基酸,軟件分析其等電點(diǎn)(pI)為8.34,分子質(zhì)量單位為39.8035ku。亞細(xì)胞定位分析該蛋白為無(wú)信號(hào)肽的細(xì)胞質(zhì)蛋白,屬于穩(wěn)定蛋白;結(jié)構(gòu)域和保守功能域的預(yù)測(cè),FBPAI的激活位點(diǎn)為VYLEGTLLKPN(222aa-232aa),并含有TIMβ/α筒狀結(jié)構(gòu)(6aa-346aa),二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和環(huán)狀結(jié)構(gòu)居多,無(wú)跨膜區(qū),有10種類型的活性位點(diǎn)。經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序證實(shí)pET30a(+)-EgFBPA構(gòu)建成功。SDS-PAGE檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量與預(yù)期相符,且具有可溶性;Bradford法測(cè)定蛋白濃度為(0.50±0.02)mg/ml。酶活性檢測(cè)Ni-NTA柱純化后的FBPA具有良好的酶促活性,且存在量效關(guān)系。結(jié)論生物信息學(xué)預(yù)測(cè)EgFBPA可能是潛在的藥物靶點(diǎn)。重組質(zhì)粒Pet30a(+)-FBPA在大腸埃希菌BL21中成功表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有酶促活性,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所;海南醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室;甘肅省新藥臨床前重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81171632)
【分類號(hào)】：R392
【正文快照】： 細(xì)粒棘球絳蟲病是一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病[1]。目前,治療該病最為常用的藥物是阿苯達(dá)唑,然而從6個(gè)治療中心和5個(gè)國(guó)家收集到的數(shù)據(jù)顯示,該藥物的療效可能被夸大[2]。藥物治療不僅周期長(zhǎng)、副作用大而且病人耐受性差,同時(shí)手術(shù)治療也存在對(duì)人體損傷大,易復(fù)發(fā),花費(fèi)高的

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本文編號(hào)：1290112