發(fā)布時間：2017-12-14 12:27

  本文關(guān)鍵詞：Cohn組分Ⅳ中結(jié)合珠蛋白的純化與鑒定

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【摘要】：結(jié)合珠蛋白(haptoglobin, Hp),又稱觸珠蛋白,是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白,主要由肝臟合成。它最主要的功能是與游離的血紅蛋白(hemoglobin, Hb)結(jié)合并促進(jìn)其從循環(huán)系統(tǒng)清除,從而避免對腎臟的損傷。早在20世紀(jì)50年代,人們就開始了以血漿為原料分離純化結(jié)合珠蛋白的研究。然而,純化效率低、成本高影響結(jié)合珠蛋白的規(guī)�；苽�。1985年,結(jié)合珠蛋白濃縮制劑在日本上市,用于急性溶血狀態(tài)下一般性治療或者預(yù)防性使用,包括燒傷、燙傷、輸血、體外循環(huán)心臟直視術(shù)等引起的溶血反應(yīng)伴血紅蛋白血癥或血紅蛋白尿,以及手術(shù)干預(yù)前的預(yù)防性使用等。但是,到目前為止,歐洲、美國和中國尚無結(jié)合珠蛋白產(chǎn)品批準(zhǔn)用于臨床。本研究以血漿蛋白生產(chǎn)過程中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料,探索適于規(guī)模化制備結(jié)合珠蛋白的工藝。研究內(nèi)容主要包括以下五部分：首先,采用SDS-PAGE、免疫印跡及質(zhì)譜分析的方法證明了結(jié)合珠蛋白的確存在于Cohn組分Ⅳ中,明確了其多聚體在非還原性SDS-PAGE中的位置主要位于245kD附近,為后續(xù)分離純化結(jié)合珠蛋白工藝的探索奠定基礎(chǔ)。其次,本文重點(diǎn)從前處理和層析精制兩方面探索分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝。前處理工藝中,根據(jù)Cohn組分Ⅳ中目的蛋白及主要雜蛋白(白蛋白、儀1抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等)的分子結(jié)構(gòu)及特性,分別采用PEG沉淀法、硫酸銨沉淀法、利凡諾-鹽析組合法三種方法進(jìn)行前處理,通過對比分析具體數(shù)據(jù),結(jié)果表明利凡諾-鹽析組合法是較為可取的方法,該方法能夠有效去除雜蛋白,以白蛋白等小分子雜蛋白去除效果明顯,并使目的蛋白富集,使后續(xù)層析效果達(dá)到最佳,是一種簡單、有效的前處理方法,適用于規(guī)�；那疤幚磉^程。層析分離工藝中,本研究探索三種不同的介質(zhì)(DEAE-Sephrose Fast Flow、QMA Spherosil M、Q-Sepharose Fast Flow)分別在不同pH條件下分離純化結(jié)合珠蛋白的效果。綜合比較發(fā)現(xiàn),采用Q-Sepharose Fast Flow層析的分離方法,SDS-PAGE顯示其純度較好,且目的蛋白損失相對較少。此外,采用利凡諾-鹽析的前處理方法對結(jié)合珠蛋白進(jìn)行粗純,利用Q-Sepharose Fast Flow層析在pH5.5條件下實現(xiàn)對目的蛋白的分離,對工藝整體進(jìn)行適當(dāng)放大,結(jié)果表明工藝整體較為穩(wěn)定。最后,利用Native-PAGE方法測的采用該工藝小試和適當(dāng)放大后分離得到的目的蛋白的血紅蛋白結(jié)合活性分別為2.8U/mL(10mg/mL)、3.75U/mL (15mg/mL)。采用免疫印跡及質(zhì)譜分析進(jìn)一步證明該方法成功分離得到目的蛋白。本研究以血液制品生產(chǎn)中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料,探索分離純化結(jié)合珠蛋白的前處理及層析精制工藝,初步建立了利凡諾絡(luò)合-鹽析-Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝,該工藝簡單,易于放大生產(chǎn),具有較好應(yīng)用前景。本研究為人結(jié)合珠蛋白的分離純化提供可參考借鑒的數(shù)據(jù),為建立更加簡便經(jīng)濟(jì)適用的結(jié)合珠蛋白生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1287901