本文關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備及其噬菌體模擬表位的篩選

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【摘要】：赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的某些種產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物,包含七種結(jié)構(gòu)類似的化合物,其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)最普遍且毒性最強(qiáng)。OTA具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突變等特性,對(duì)動(dòng)物和人體健康有很大的潛在危害,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)于1993年將OTA列為2B類致癌物。目前,用于檢測OTA的高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、熒光檢測法等方法的樣品前處理步驟繁瑣、成本高、要求專業(yè)人員進(jìn)行操作,不適合大批量樣品的檢測。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)不僅具有較好的靈敏度和特異性,而且對(duì)檢測樣品純度要求低,操作簡單可行,適合大批量樣品的檢測。但是,酶聯(lián)免疫分析法的競爭性檢測是建立在酶標(biāo)記毒素或載體偶聯(lián)毒素作為競爭抗原基礎(chǔ)上的有毒檢測體系,而且還存在標(biāo)品毒素昂貴、進(jìn)口受限、偶聯(lián)反應(yīng)繁瑣以及操作人員的身體健康受到威脅等缺點(diǎn)。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)有力的解決了這一難題。利用噬菌體展示技術(shù)通過淘選可以得到OTA的模擬表位,以無毒的模擬表位代替有毒的標(biāo)品毒素用于毒素的檢測當(dāng)中,有效的解決了OTA毒性大、操作不便等問題,為實(shí)驗(yàn)人員的人身安全提供了保證。本論文研究的主要內(nèi)容如下:1.赭曲霉毒素A完全抗原的合成與鑒定采用活性酯法(NHS)將OTA分別與大分子載體即蛋白牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)進(jìn)行連接,制備了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA。紫外掃描和SDS-PAGE鑒定表明OTA與BSA、OTA與OVA偶聯(lián)成功,偶聯(lián)比分別為7:1和4.5:1。用制備的免疫原OTA-BSA免疫Bal b/c小鼠制備多克隆抗體,用制備的包被原OTA-OVA包被ELISA板進(jìn)行檢測,結(jié)果表明所制備的人工抗原具有很好的免疫原性,小鼠血清中抗OTA的抗體最高效價(jià)可達(dá)1:512000,為OTA單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。2.赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備與鑒定用制備的人工抗原OTA-BSA免疫6周齡Bal b/c小鼠,經(jīng)四次免疫后,測定小鼠血清中抗OTA的抗體效價(jià)及其敏感性,選擇免疫效果較好的小鼠,取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP 2/0)進(jìn)行融合,用間接ELISA和間接競爭ELISA進(jìn)行篩選。經(jīng)3次亞克隆后得到2株可以穩(wěn)定分泌抗OTA的單克隆細(xì)胞株,分別命名為1B2和2G3。體內(nèi)誘生腹水法制備單抗腹水,辛酸-硫酸銨法對(duì)其進(jìn)行純化。經(jīng)ELISA方法鑒定表明:2株單克隆抗體的效價(jià)均可達(dá)10-6,IC50值分別為0.723ng/mL和0.683ng/mL,親和力常數(shù)分別為3.05×1010L/moL和2.56×1011L/moL,經(jīng)抗鼠單克隆抗體亞型試劑盒鑒定,2株單抗的亞型均為IgG1型。3.赭曲霉毒素A模擬表位的親和淘選以純化后的抗OTA單克隆抗體為靶標(biāo),親和淘選噬菌體隨機(jī)七肽庫。共進(jìn)行4輪淘選,在第4輪淘選的洗脫物滴度測定過程中,從總藍(lán)斑數(shù)不到100的平板上挑取20個(gè)噬菌斑克隆,經(jīng)間接ELISA和間接競爭ELISA確定陽性噬菌體克隆。將這些陽性克隆進(jìn)行測序、分析和翻譯,得出模擬表位的氨基酸序列。以單克隆抗體1B2為靶分子,所篩選出的模擬表位序列均為TTQVLEA;以單克隆抗體2G3為靶分子的篩選中,得到了兩種模擬表位序列,分別為VIGNSDP和QQSWLHI。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11

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本文編號(hào)：1254016