本文關(guān)鍵詞：Stra8在精子發(fā)生中的表達(dá)研究

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【摘要】：維生素A通過其代謝產(chǎn)物視黃酸(retinoic acid, RA)在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。Stra8 (stimulated by retinoic acid gene)是一種能夠被RA特異性誘導(dǎo)活化的基因,其表達(dá)具有發(fā)育階段性,且在生殖腺中特異表達(dá)。Stra8基因敲除雄性小鼠不育,但其在精子發(fā)生中的作用機(jī)制尚未闡明。本課題從Stra8多克隆抗體的制備、Stra8過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及Stra8在不同模型小鼠睪丸組織中的表達(dá)三個(gè)方面初步探索了Stra8在精子發(fā)生中的表達(dá)情況,為深入研究Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。第一,進(jìn)行了Stra8原核蛋白的表達(dá),應(yīng)用純化的Stra8蛋白免疫小鼠,獲得了特異性Stra8多克隆抗體。首先通過PCR擴(kuò)增,獲得Stra8開放閱讀框全長(zhǎng)基因片段,應(yīng)用分子克隆的方法插入到原核蛋白表達(dá)載體pET28a+中,構(gòu)建了Stra8原核表達(dá)載體pET28a-Stra8。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) plus后,用IPTG誘導(dǎo)Stra8原核蛋白表達(dá),His-Tag柱親和層析純化蛋白,透析復(fù)性,用復(fù)性后的Stra8蛋白為抗原,腹腔注射免疫BalB/C小鼠,獲得了小鼠Stra8多克隆抗體,并分別用ELISA、Western blot及免疫熒光檢測(cè)法證實(shí)所得到的多克隆抗體能夠特異性識(shí)別Stra8。第二,應(yīng)用慢病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)Stra8的小鼠精原細(xì)胞株。將Stra8開放閱讀框全長(zhǎng)基因片段插入慢病毒載體GV341中,構(gòu)建了慢病毒重組表達(dá)載體GV341-Stra8。然后將GV341-Stra8及兩種輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,收集含慢病毒顆粒的上清,用濃縮后的慢病毒上清感染小鼠精原細(xì)胞系細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選后,獲得了穩(wěn)定過表達(dá)Stra8的小鼠精原細(xì)胞株。應(yīng)用Western blot及免疫熒光檢測(cè)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Stra8過表達(dá)的鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的細(xì)胞株能表達(dá)大量的Stra8蛋白,且Stra8蛋白同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,以細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)居多。第三,成功制備了維生素A缺乏(vitamin A deficient, VAD)雄性小鼠及VAD恢復(fù)雄性小鼠模型,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分析了Stra8在不同模型小鼠睪丸組織中的表達(dá)情況。用VAD飼料喂養(yǎng)雌雄性小鼠兩周后合籠,新生雄性小鼠VAD飼料喂養(yǎng)13-14周后獲得VAD小鼠。取100天左右VAD小鼠,給予維生素A正常的飲食,維持35天以上即可獲得VAD恢復(fù)模型小鼠。應(yīng)用HE染色法對(duì)睪丸組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。在此基礎(chǔ)上選取模型小鼠不同時(shí)期睪丸組織,通過Western blot、免疫熒光化學(xué)等方法研究Stra8的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),VAD小鼠從VAD飲食第81天起部分生精小管即開始出現(xiàn)生精紊亂,到100天時(shí),生精小管中僅有支持細(xì)胞和少量精原細(xì)胞。VAD小鼠恢復(fù)正常飲食后第9天起,生精小管中初級(jí)精母細(xì)胞即開始出現(xiàn),并逐漸增多,25天時(shí)基本可見到各種階段的生精細(xì)胞,至35天時(shí)所有生精小管均完全恢復(fù)了正常。對(duì)Stra8蛋白的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在VAD小鼠的不同階段,Stra8在睪丸組織中的表達(dá)具有逐漸減少的趨勢(shì),而VAD恢復(fù)組小鼠睪丸組織中的不同階段,Stra8蛋白的表達(dá)水平隨著精子發(fā)生的改善而呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)。通過上述研究,我們獲得了特異性的Stra8多克隆抗體,構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)Stra8小鼠精原細(xì)胞株,同時(shí),構(gòu)建了VAD及VAD恢復(fù)小鼠模型,并分析了Stra8蛋白在模型小鼠不同階段的表達(dá)情況。這些研究為將來進(jìn)一步研究Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R321.1

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