本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲自噬相關(guān)蛋白3基因的克隆表達(dá)與多抗制備

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【摘要】：目的克隆、表達(dá)剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)自噬相關(guān)蛋白3(Tg Atg3)基因,并制備能特異性識別該蛋白的多克隆抗體。方法以弓形蟲RH株c DNA為模板,構(gòu)建p ET28a-Tg Atg3重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coli)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá),用鎳柱親和層析法純化誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物,以小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體作為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)進行鑒定。以純化的Tg Atg3蛋白作為抗原皮下多點注射免疫日本大耳白兔,125μg/(只·次),免疫4次后心臟取血,制備血清,獲得特異性抗Tg Atg3多克隆抗體。對制備的多克隆抗體進行Western blotting與間接免疫熒光法(IFA)鑒定。結(jié)果雙酶切、PCR擴增及測序結(jié)果證實目的片段序列正確,原核表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-Tg Atg3構(gòu)建成功。SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明,重組E.coli中可見相對分子質(zhì)量(Mr)約44 000的可溶性Tg Atg3蛋白的高效表達(dá)。抗體檢測Western blotting結(jié)果顯示,制備的多克隆抗體能特異性識別弓形蟲RH株的Tg Atg3蛋白。IFA結(jié)果顯示,該多克隆抗體可與蟲體胞漿內(nèi)Tg Atg3結(jié)合。結(jié)論獲得重組可溶性Tg Atg3蛋白,制備的多克隆抗體能特異性識別弓形蟲RH株的天然Atg3蛋白。
【作者單位】： 東陽市人民醫(yī)院檢驗科;溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院;溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院;
【基金】：浙江省自然科學(xué)基金(No.LY12H19004,LQ14H190003) 浙江省科技廳公益性項目(No.2014C33161) 浙江省新苗人才計劃(No.2014R413082)~~
【分類號】：R382.5
【正文快照】： (1 Clinical Laboratory,Dongyang People’s Hospital,Jinhua 322100,China;2 School of Basic MedicalSciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China;3 The First Clinical Medical College,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China;4 School of Medi

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3 鄒s舠，

本文編號：1181914