本文關(guān)鍵詞：VNN1調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)下的肝臟Hepcidin表達(dá)及肝鐵紊亂的分子機(jī)制

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【摘要】：鐵代謝紊亂是一種常見的疾病,與炎癥、糖尿病、心血管等代謝性疾病息息相關(guān),嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。因此,深入研究機(jī)體鐵代謝的精密調(diào)控顯得尤為重要。Hepcidin是一種肝臟合成并分泌的抗菌多肽,富含半胱氨酸,它在調(diào)控機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵性作用。簡單地說,機(jī)體內(nèi)的Hepcidin可以與位于巨噬細(xì)胞和腸細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的Ferroportin1 (FPN1)蛋白結(jié)合,進(jìn)而將其內(nèi)化和降解。由于FPN1是胞內(nèi)鐵輸出的唯一通道,所以,Hepcidin可以通過調(diào)節(jié)FPN1來調(diào)控機(jī)體鐵運(yùn)輸。機(jī)體內(nèi)Hepcidin的水平處于動態(tài)平衡中,如果這個(gè)平衡被打破,會導(dǎo)致鐵的缺乏或過載,從而引發(fā)一系列疾病。因此,維持機(jī)體Hepcidin的動態(tài)平衡就變得至關(guān)重要。研究表明,Hepcidin的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié),如機(jī)體的鐵水平、炎癥和缺氧。除此以外,人類許多代謝性紊亂疾病也與Hepcidin的紊亂密切相關(guān),如遺傳性血色素沉著病(hereditary hemochromatosis, HH)、炎性貧血(anemia of inflammation, AI)、慢性腎病(chronic kidney diseases)等。臨床數(shù)據(jù)顯示,在慢性炎癥病人體內(nèi)Hepcidin的表達(dá)比健康人群要高,從而引發(fā)炎性貧血。對于這方面的機(jī)制研究,目前僅停留在炎性因子IL-6可通過STAT-3 (signal transduction and activator of transcription-3)信號通路增加Hepcidin的表達(dá),但哪些媒介物傳遞炎癥信號來調(diào)控肝鐵穩(wěn)態(tài)尚未知曉。VNN1是一種在腸和肝臟組織中高表達(dá)的GPI-錨定蛋白質(zhì),具有泛酰巰基乙胺酶的活性。該酶水解泛酰巰基乙胺(pantetheine)形成巰基乙胺(pantothenic acid, vitamin B5)和半胱胺(Cysteamine)。研究表明,半胱胺(Cysteamine)在體內(nèi)通過巰基二硫化物的交換反應(yīng)生成氧化形式的胱胺(Cystamine),而胱胺正是許多重要代謝途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。實(shí)驗(yàn)證明,VNN1全身性敲除的小鼠能抵抗2,4,6-三硝基苯磺酸基酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)造成的大腸炎。然而,令人驚奇的是,用胱胺處理上述小鼠可以完全逆轉(zhuǎn)這種保護(hù)機(jī)制。綜合前人的研究結(jié)果,我們不難發(fā)現(xiàn)炎癥信號、VNN1及Hepcidin之間似乎存在著某種聯(lián)系,因此,本文主要探究在炎癥狀態(tài)下,VNN1調(diào)節(jié)肝臟Hepcidin表達(dá)及肝鐵穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。本文主要采用功能獲得(gain-of-function)和功能缺失(loss-of-function)的過表達(dá)和干擾的方法。在細(xì)胞水平研究炎癥狀態(tài)下,VNN1調(diào)節(jié)Hepcidin表達(dá)及其分子機(jī)制。運(yùn)用VNN1腺病毒和小干擾RNA siVNN1介導(dǎo)的過表達(dá)和干擾技術(shù),采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot分析VNN1對Hepcidin表達(dá)的影響。同時(shí),運(yùn)用普魯士藍(lán)染色的方法分析肝鐵堆積情況。在分子機(jī)制層面,我們檢測了NF-κB的活性變化。隨后,運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(Luciferase reporter assay)實(shí)驗(yàn),研究VNN1調(diào)控hepcidin基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)制。我們的研究結(jié)果證明,在小鼠的原代肝細(xì)胞中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能顯著性地上調(diào)VNN1和Hepcidin的表達(dá)水平,該結(jié)果暗示了VNN1可能在LPS調(diào)控Hepcidin表達(dá)的過程中發(fā)揮著潛在的作用。過表達(dá)VNN1濃度梯度依賴性地增加Hepcidin的表達(dá)和肝鐵堆積,而干擾VNN1出現(xiàn)相反的效果。上述結(jié)果表明,VNN1和Hepcidin的表達(dá)水平呈正相關(guān)性。最重要的是,干擾VNN1有效地拮抗LPS誘導(dǎo)Hepcidin的表達(dá)及肝鐵紊亂。在分子機(jī)制層面上,NF-κB作為經(jīng)典的信號通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng),同時(shí),近年報(bào)道也表明在hepcidin基因啟動子的-509 bp有一個(gè)NF-κB的結(jié)合位點(diǎn),可以激活hepcidin基因的轉(zhuǎn)錄,所以,我們推測VNN1可能是通過激活NF-κB的活性在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控hepcidin基因的表達(dá)。我們通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明VNN1激活NF-κB的核轉(zhuǎn)位。此外,BAY 11-7082 (NF-κB的抑制劑)處理能部分削弱過表達(dá)VNN1對Hepcidin的上調(diào)效果。普魯士藍(lán)染色的結(jié)果也驗(yàn)證了上述結(jié)果。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明NF-κB參與VNN1調(diào)控Hepcidin表達(dá)的過程。而干擾VNN1也能部分緩解LPS對NF-κB的激活效果。熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)表明,干擾VNN1有效地抑制LPS對hepcidin基因啟動子的激活作用。另一方面,我們的實(shí)驗(yàn)中VNN1的水解產(chǎn)物半胱胺(Cysteamine)的氧化形式胱胺(Cystamine)完全逆轉(zhuǎn)干擾VNN1對Hepcidin表達(dá)的抑制作用,進(jìn)一步證明了VNN1確實(shí)在調(diào)節(jié)肝臟Hepcidin的表達(dá)和維持肝鐵穩(wěn)態(tài)過程中起著關(guān)鍵性的作用。綜上所述,我們的研究充分證明,在細(xì)胞水平上,VNN1增加肝臟Hepcidin的表達(dá)及肝鐵堆積,而NF-κB的核轉(zhuǎn)位在該現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的作用。此外,VNN1的水解產(chǎn)物之一半胱胺也參與此過程。我們的研究首次探討了細(xì)胞膜錨定蛋白VNN1、 Hepcidin及肝鐵堆積之間的關(guān)系,并從分子機(jī)制層面對其進(jìn)行了深入的研究,豐富了現(xiàn)有VNN1的功能,并進(jìn)一步完善了Hepcidin調(diào)節(jié)肝鐵穩(wěn)態(tài)的理論認(rèn)知,同時(shí)為從不同角度治療炎癥相關(guān)的肝鐵紊亂的代謝性疾病提供了新的理論依據(jù)和藥物靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R363

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