本文關(guān)鍵詞：抗VEGF單克隆抗體Fab片段在E.coli中的分泌表達(dá)

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【摘要】：目的:在大腸桿菌中構(gòu)建、表達(dá)和純化抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的Fab片段(蘭尼單抗,ranibizumab),通過發(fā)酵條件的控制實現(xiàn)其在大腸桿菌周質(zhì)和胞外的高效分泌表達(dá),并檢測其抗VEGF的活性。方法:以pET30a為質(zhì)粒載體,構(gòu)建了Fd鏈和L鏈前都含有OmpA信號肽、SD序列和T7 promoter的克隆載體pET30a(+)-LC-HC,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌株,并進(jìn)行了培養(yǎng)基、溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度的條件優(yōu)化。結(jié)果:確定Fab片段在大腸桿菌分泌表達(dá)搖瓶發(fā)酵最佳條件為:在含有1.5%Tryptone,1%Yeast Extract,0.5%Glucose,0.15%NaCl,0.1%NH4Cl,0.08%MgCl2·6H2O的1L培養(yǎng)基的搖瓶中,按照10%的接種量,37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期(OD600為2左右),添加0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑,于16℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)過夜(16h左右)。用周質(zhì)破菌提取分泌至大腸桿菌周質(zhì)腔的Fab片段,同時用中空纖維柱濃縮發(fā)酵培養(yǎng)基,最后用ProteinG親和層析柱一步純化洗脫,經(jīng)SDS-PAGE檢測分析和Brandford法測蛋白濃度得出純化的Fab抗體片段純度在90%以上,分泌表達(dá)純化量為0.4mg/L。以VEGF165作為結(jié)合抗原,間接ELISA分析純化后的Fab抗體EC50=30ng/ml。繼續(xù)用該培養(yǎng)基在3.7L體積發(fā)酵罐中進(jìn)行2L體積的發(fā)酵,獲得最終的菌體產(chǎn)率為30g/L,可親和純化Fab抗體量為1.94mg/L。結(jié)論:成功實現(xiàn)了Fab抗體片段在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá),且具有很高的活性,為規(guī)�；苽銯ab抗體片段提供了研究依據(jù)。
【作者單位】： 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室;上海近岸科技有限公司;
【分類號】：R392;Q786
【正文快照】： 目前抗體片段在抗感染、抗自身免疫疾病和抗腫瘤等臨床治療、分子診斷以及基礎(chǔ)研究中已經(jīng)成為強(qiáng)大的武器工具[1]。例如,靶向VEGF的抗體類藥物[2-3]目前已經(jīng)成為腫瘤治療[4]的研究熱點,其中已經(jīng)上市的人源化抗體Avastin,Lucentis等已經(jīng)取得巨大的成功并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

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