本文關(guān)鍵詞：CHO細胞表達重組人絨毛膜促性腺激素性腺激素的調(diào)控機理研究

  更多相關(guān)文章： 細胞培養(yǎng) 人絨毛促性腺激素(hCG) 表達調(diào)控機理

【摘要】：人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)是由胎盤滋養(yǎng)細胞合成和分泌的一種雙亞基糖蛋白激素,在治療女性不孕、誘導(dǎo)排卵以及某些疾病的檢測中起到重要的作用。傳統(tǒng)hCG的生產(chǎn)方法是從孕婦尿中提取,但這種方法存在許多缺點,比如來源不受控制,純化困難,批次間差異較大等,限制了hCG的臨床使用。目前已有商品化的重組hCG (rhCG)上市,但由于對蛋白表達的調(diào)控機理缺乏了解,蛋白表達水平偏低。本文通過FLP-In定點整合系統(tǒng)篩選出了不同rhCG表達水平的穩(wěn)定細胞株,并通過對不同表達水平細胞株的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、組裝折疊水平以及分泌水平的研究,揭示了rhCG蛋白表達的限制因素。 通過考察不同表達水平細胞株的mRNA豐度以及mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄速率,以及通過ELISA檢測方法檢測不同表達水平細胞株的胞內(nèi)胞外α亞基多肽、β亞基多肽以及完整hCG蛋白濃度,本文揭示了rhCG蛋白表達過程的各種限制因素：第一,不同表達水平細胞株β亞基的mRNA水平相對較高,這可能是rhCG蛋白表達所必需的,過量的β亞基合成可能能夠促進rhCG的合成。進一步通過驗證mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄速率,證實了轉(zhuǎn)錄水平的差異并不是由于各亞基mRNA的穩(wěn)定性差異引起的而是由于轉(zhuǎn)錄速率的差異引起的；第二,相比于β亞基的mRNA豐度,高表達細胞株中α亞基的轉(zhuǎn)錄水平存在明顯限制；第三,在高表達細胞株中,無論是α亞基還是β亞基其從mRNA到多肽的合成步驟均存在明顯限制,β亞基的限制尤其顯著。這可能與β亞基的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān),β亞基比α亞基多一個鏈內(nèi)二硫鍵和四個O糖鏈,細胞O糖鏈修飾能力的缺乏可能是導(dǎo)致這種限制發(fā)生的主要原因；第四,在本研究的rhCG蛋白表達水平下,蛋白在組裝和分泌水平均不存在明顯限制。 本文提出了一種雙亞基蛋白表達調(diào)控機理研究的方法,揭示了rhCG蛋白表達過程的限制因素,對于構(gòu)建高表達的rhCG工程細胞株具有重要的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：細胞培養(yǎng) 人絨毛促性腺激素(hCG) 表達調(diào)控機理
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 文獻綜述10-23
• 1.1 人絨毛膜促性腺激素10-12
• 1.1.1 人絨毛膜促性腺激素的簡介10-11
• 1.1.2 人絨毛膜促性腺激素的臨床作用11
• 1.1.3 人絨毛膜促性腺激素的生產(chǎn)方法簡介11-12
• 1.2 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白藥物12-14
• 1.2.1 國內(nèi)外重組蛋白藥物的發(fā)展進程12
• 1.2.2 中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達系統(tǒng)12-14
• 1.3 定點整合系統(tǒng)篩選穩(wěn)定表達細胞株14-17
• 1.3.1 FLP-In定點整合系統(tǒng)的簡介14-17
• 1.3.2 FLP-In定點整合系統(tǒng)的優(yōu)點17
• 1.4 實時熒光定量PCR17-19
• 1.4.1 實時熒光定量PCR的簡介17-18
• 1.4.2 實時熒光定量PCR的相對定量18-19
• 1.4.3 實時熒光定量PCR的絕對定量19
• 1.4.4 實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用19
• 1.5 外源基因在哺乳動物細胞表達過程中限制因素的研究19-21
• 1.5.1 載體設(shè)計、質(zhì)粒整合和染色體環(huán)境20
• 1.5.2 mRNA的穩(wěn)定性和加工處理20-21
• 1.5.3 蛋白質(zhì)的翻譯和分泌21
• 1.6 研究內(nèi)容與研究意義21-23
• 第2章 人絨毛膜促性腺激素表達載體的構(gòu)建23-40
• 2.1 前言23
• 2.2 實驗材料23-24
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.2.2 培養(yǎng)基和溶液23-24
• 2.2.3 主要試劑、試劑盒、儀器設(shè)備及分析軟件24
• 2.3 實驗方法24-31
• 2.3.1 菌種培養(yǎng)和保藏24
• 2.3.2 質(zhì)粒抽提步驟24-25
• 2.3.3 瓊脂糖凝膠回收步驟25
• 2.3.4 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備步驟25-26
• 2.3.5 DH5α感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化26
• 2.3.6 包含兩個PCMV-BGHpA表達框的pcDNA5/FRT載體構(gòu)建26-28
• 2.3.7 含有α亞基的pcDNA5/FRT(2)-α載體的構(gòu)建28-30
• 2.3.8 含有α亞基和β亞基的pcDNA5/FRT-hCGαβ載體的構(gòu)建30-31
• 2.4 實驗結(jié)果31-39
• 2.4.1 包含兩個PCMV-BGHpA表達框的pcDNA5/FRT載體構(gòu)建31-35
• 2.4.2 含有α亞基的pcDNA5/FRT(2)-α載體構(gòu)建35-37
• 2.4.3 含有β亞基的pcDNA5/FRT-hCGαβ載體構(gòu)建37-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第3章 FLP-In定點整合系統(tǒng)和流式細胞儀細胞分選技術(shù)的建立40-47
• 3.1 前言40
• 3.2 實驗材料40-42
• 3.2.1 細胞株、質(zhì)粒40-41
• 3.2.2 培養(yǎng)基和溶液41
• 3.2.3 實驗試劑和儀器41-42
• 3.3 實驗方法42-43
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)42
• 3.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染42
• 3.3.3 流式細胞儀檢測細胞的轉(zhuǎn)染效率42
• 3.3.4 FLP-In定點整合系統(tǒng)宿主細胞株的篩選42-43
• 3.3.5 FLP-In定點整合系統(tǒng)表達細胞株的篩選43
• 3.4 實驗結(jié)果43-45
• 3.4.1 FLP-In定點整合系統(tǒng)宿主細胞系篩選轉(zhuǎn)染效率的測定43-44
• 3.4.2 流式細胞儀分選細胞44-45
• 3.5 小結(jié)45-47
• 第4章 CHO細胞表達rhCG蛋白的表達調(diào)控機理研究47-59
• 4.1 前言47
• 4.2 實驗材料47-48
• 4.2.1 細胞株、培養(yǎng)基47
• 4.2.2 實驗試劑和儀器47-48
• 4.3 實驗方法48-52
• 4.3.1 總RNA抽提和hCG mRNA的測定48-49
• 4.3.2 hCG各亞基mRNA穩(wěn)定性分析49
• 4.3.3 實時熒光定量PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備49-50
• 4.3.4 轉(zhuǎn)錄速率分析50-51
• 4.3.5 ELISA方法檢測hCG各亞基和完整hCG蛋白的濃度51-52
• 4.4 實驗結(jié)果52-57
• 4.4.1 不同表達水平細胞株各亞基mRNA水平的比較52-53
• 4.4.2 不同表達水平細胞株各亞基mRNA穩(wěn)定性的比較53-54
• 4.4.3 不同表達水平細胞株轉(zhuǎn)錄速率的比較54-55
• 4.4.4 不同表達水平細胞株胞內(nèi)胞外α亞基多肽和β亞基多肽水平的比較55-56
• 4.4.5 不同表達水平細胞株胞內(nèi)胞外完整rhCG蛋白濃度的比較56-57
• 4.5 小結(jié)57-59
• 第5章 總結(jié)與展望59-61
• 5.1 總結(jié)59
• 5.2 主要創(chuàng)新點59-60
• 5.3 展望60-61
• 參考文獻61-68
• 致謝68

【共引文獻】

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9 田，

本文編號：1087422